دانشکده علوم
پاياننامه کارشناسي ارشد در رشته زيست شناسي(علوم سلولي و مولکولي)
مطالعه اثر مايعات يوني بر پايداري و فعاليت هيدرولازي آنزيم ليپاز ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس
به کوشش:
مينا صلحطلب
استاد راهنما:
دکتر حميدرضا کربلايي حيدري
دي ماه 1393
تقديم
به خداوندي که مرا آفريد
قدرت تفکرم بخشيد و خانه درونم را به نور آموختن روشن فرمود
به پيامبر علم و رحمت
محمد رسول الله (صلي الله عليه و آله و سلم)
و به آنان که مهر آسماني شان آرام بخش آلام زميني ام است
به استوارترين تکيه گاهم،دستان پرمهر پدرم
به مهربانترين نگاه زندگي ام، وسعت بيکران چشمان مادرم
و به همسر مهربانم
به پاس مهر بيکرانش، همراهي و رهنمونهاي بي دريغش
سپاسگذاري
با سپاس فراوان از راهنمائي‌ها و زحمات استاد محترم و گرانقدر جناب آقاي دکتر کربلايي حيدري که از ابتداي راه و در طي انجام اين تحقيق، با راهنمائي‌هاي خود مرا در نگارش اين اثر ياري نمودند.
همچنين قدر داني و تقدير از اساتيد بزرگوار مشاور ، جناب آقاي دکتر آبسالان و جناب آقاي دکتر يوسفي که با هدايت و حمايت‌هاي بي دريغشان ياري‌ام نمودند.
هم چنين از همه افرادي که به هر نوعي مرا در اجراي اين پژوهش ياري نمودند قدرداني مي نمايم.
چکيده
مطالعه اثر مايعات يوني بر پايداري و فعاليت هيدرولازي آنزيم
ليپاز ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس
به کوشش
مينا صلح طلب
مايعات يوني را ميتوان به عنوان محيط واکنشهاي بيوکاتاليز جايگزينهايي سبز براي حلالهاي آلي به شمار برد. ترکيبات مختلفي از کاتيونها و آنيونها را ميتوان جهت دستيابي به طيف وسيعي از مايعات يوني با ويژگيهاي فيزيکي شيميايي مختلف به کار برد. با توجه به گستره وسيع خصوصيات مايعات يوني، نياز است که مايعات يوني مناسب براي هر آنزيم خاص و هر محيط واکنش خاص مشخص شود. آنزيم ليپاز ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس (TTL) يک ليپاز مقاوم به دما است که اختصاصيت انانتيومري خوبي نسبت به الکلهاي ثانويه دارد. بنابراين از TTL ميتوان به عنوان يک آنزيم بالقوه صنعتي، در انجام واکنش هاي تفکيک مخلوطهاي راسميک استفاده کرد. در اين پژوهش فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL در حضور غلظتهاي مختلف مايعات يوني [CnMIM][Br] (12، 6، 4، 2 = n) مورد بررسي قرار گرفت. با توجه به اين موضوع که پايداري دمايي آنزيم در محيطهاي حاوي مايعات يوني يک شرط مهم براي استفاده از اين محيطها در فرآيندهاي صنعتي ميباشد، پايداري دمايي آنزيم از نظر سينتيکي و ساختاري در 10 نوع مايع يوني با کاتيونها و آنيونهاي مختلف مورد بررسي قرار گرفت. نتايج افزايش فعاليت هيدرولازي و پايداري دمايي آنزيم TTL در مايعات يوني نسبت به محيط بافري را نشان ميدهد. غلظت بهينه مايعات يوني [CnMIM][Br] در جهت افزايش فعاليت آنزيمي نيز به دست آمد. نتايج نشان داد که آنزيم TTL به ترتيب در غلظت هاي 3/0، 1 و 3/0 مولار از مايعات يوني [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] بهترين فعاليت را داشته است. در حاليکه در مورد مايع يوني [C12MIM][Br] هيچ اثر مثبتي بر فعاليت هيدرولازي آنزيم مشاهده نشد. همچنين مشخص گرديد که نوع کاتيون و نوع آنيون مايعات يوني، شدت اثر آنها بر پايداري آنزيم TTL را تحت تأثير قرار ميدهد. نوع آنيون به دليل اندازه کوچک و چگالي بار بالايي که دارند، اهميت بيشتري نسبت به نوع کاتيون دارد. در مقايسهاي که بين مايعات يوني [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهاي بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مايع يوني داراي آنيون PF6- اثر پايدارکننده بيشتري را براي آنزيم TTL ايجاد کرد. پايداري آنزيم در حضور مايعات يوني با طول زنجيره آلکيلي کوتاه و متوسط، مشابه بود. هرچند مايعات يوني با زنجيره کاتيوني طويل اثر منفي بر پايداري ساختار آنزيم ميگذارند. همچنين در اين پژوهش نشان داده شد با تغيير نوع کاتيون از پايه ايميدازوليوم به پايه پيريدينيوم تغيير زيادي در ميزان پايداري ديده نميشود. مطالعات ساختاري پايداري دمايي آنزيم پس از حرارتدهي در °C 85، با روش اسپکتروسکوپي فلورسانس نيز انجام شد. مطالعه فلورسانس ذاتي TTL نشان داد که در مايعات يوني با آنيون PF6- ساختار آنزيم تا حد زيادي حفظ ميشود؛ به طوري که تفاوت کمي بين شدت نشر فلورسانس قبل و بعد از 1 ساعت حرارتدهي در °C 85 ديده ميشود. در مايعات يوني [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] بعد از 45 دقيقه آنزيم همچنان بيش از 50 % از فعاليت خود را حفظ کرد. اين درحالي است که پايداري آنزيم در محيط آبي در دماهاي بالاتر از °C 80 کمتر از 15 دقيقه است. با توجه به يافته هاي پژوهش حاضر، مي توان از آنزيم TTL براي کاتاليز فرايندهاي زيستي در مايعات يوني و دماهاي بالا بهره برد.
کلمات کليدي: مايعات يوني، ليپاز، ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس ، پايداري دمايي.
فهرست مطالب
عنوانصفحهفصل اول: مقدمه
1-1- آنزيمها21-2- ليپازها31-2-1- ارتباط ساختار آنزيم ليپاز با عملکرد آن51-3- آنزيمها در محيط آلي61-4- مايعات يوني81-5- بيوکاتاليز در مايعات يوني91-5-1- آنزيمها در مخلوطهاي مايع يوني – آب101-5-2- فعاليت آنزيمها در شرايط نسبتا بيآب در مايعات يوني111-5-3- پايداري آنزيمها در مايعات يوني تقريبا بيآب131-5-4- آنزيمها، مايعات يوني، پيوندهاي هيدروژني و فعاليت131-5-5- بيوترانسفورماسيون در محيط مايعات يوني توسط ليپازها و استرازها141-6- بررسي ساختار پروتئين به روش اسپکتروسکوپي فلورسانس15فصل دوم: مروري بر پژوهشهاي پيشين

2-1- پيشينه کاربرد مايعات يوني در بيوکاتاليز182-2- اثر مايعات يوني مختلف بر فعاليت و پايداري آنزيم192-3- بررسي ساختار آنزيمها در مايعات يوني22اهداف23فرضيه23فصل سوم: مواد و روشها

3-1- ابزار25
عنوانصفحه3-2- مواد263-2-1- مواد لازم جهت تهيه مايعات يوني263-2-2- مواد لازم جهت تهيه آنزيم ليپاز درون سلولي TTL263-2-2-1- سوش باکتري263-2-2-2- مواد مورد نياز براي ترانسفورماسيون263-2-2-3- مواد مورد نياز براي کشت باکتري و استخراج عصاره سلولي263-2-2-4- مواد مورد نياز براي تخليص آنزيم ليپاز263-2-2-5- مواد مورد نياز براي سنجش کمي ميزان پروتئين و ژل SDS PAGE273-2-3- مواد مورد نياز براي سنجش فعاليت آنزيمي ليپاز273-2-4- نرم افزارها273-3- روشها283-3-1- روش تهيه مايعات يوني283-3-1-1- روش تهيه مايعات يوني با آنيون برميد283-3-1-2- روش تهيه مايعات يوني با آنيون هگزافلوروفسفات283-3-2- روش کشت باکتري و بيان القايي پروتئين نو ترکيب293-3-2-1- محيط کشت باکتري E. coli293-3-2-2- انتقال DNA خارجي به باکتري E.coli293-3-2-2-1- تهيه سلول هاي مستعد به روش شيميايي293-3-2-2-2- انتقال پلاسميد به سلول مستعد303-3-2-3- روش تهيه استوک باکتري313-3-2-4- کشت باکتري و القاي بيان آنزيم نوترکيب313-3-2-5- بهينه سازي بيان آنزيم نوترکيب313-3-2-5- 1- انتخاب بهترين کلني از نظر بيان آنزيم TTL313-3-2-5-2- انتخاب بهترين زمان پس از القا323-3-2-6- استخراج عصاره سلولي حاوي ليپاز TTL323-3-3- روش تخليص آنزيم ليپاز TTL333-3-3-1- روش رسوب دهي دمايي333-3-3-1-1- بهينه سازي رسوب دهي دمايي333-3-3-2- روش تخليص به کمک ستون کروماتوگرافي333-3-4- روش سنجش کمي پروتئين343-3-4-1- سنجش کمي ميزان پروتئين به روش برادفورد343-3-4-2- سنجش کمي ميزان پروتئين به روش جذب nm 28034
عنوانصفحه3-3-5- الکتروفورز ژل پليآکريل آميد با SDS (SDS-PAGE)353-3-5-1- آماده سازي محلولهاي الکتروفور353-3-5-2- آماده سازي سيستم الکتروفورز363-3-6- سنجش فعاليت آنزيمي با سوبستراي پارانيتروفنيل پالميتات383-3-7- روش بررسي فعاليت آنزيمي در حضور غلظت هاي مختلف از انواع مايعات يوني393-3-8- روش بررسي پايداري دمايي آنزيم TTL در دماهاي بالا393-3-9- روش بررسي پايداري آنزيم ليپاز TTL در حضور مايعات يوني مختلف393-3-10- روش بررسي ساختار سوم آنزيم TTL در حضور مايعات يوني40فصل چهارم: نتايج

4-1- بهينه سازي بيان آنزيم نوترکيب424-1-1- انتخاب بهترين کلني از نظر بيان آنزيم TTL434-1-2- بهينه سازي زمان پس از القا434-2- تخليص آنزيم ليپاز TTL444-2-1- بهينه سازي تخليص نسبي به روش رسوب دهي دمايي444-2-2- تخليص به کمک ستون کروماتوگرافي Q- سفاروز454-3- سنتز مايعات يوني474-4- اثر مايعات يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL474-5- اثر مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم TTL484-5-1- پايداري دمايي TTL در عدم حضور مايعات يوني484-5-2- پايداري دمايي آنزيم TTL در حضور مايعات يوني494-5-2-1- بررسي پايداري TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهاي مختلف494-5-2-2- مقايسه اثر نوع آنيون مايعات يوني بر پايداري دمايي514-5-2-3- مقايسه اثر نوع کاتيون و طولهاي مختلف زنجيره کربني مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم514-6- بررسي ساختار سوم آنزيم در حضور و عدم حضور مايعات يوني54فصل پنجم: بحث

5-1- اثر مايعات يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL57
عنوانصفحه5-2- اثر مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم TTL595-3- بررسي ساختار سوم آنزيم در حضور مايعات يوني61فصل ششم: نتيجهگيري و پيشنهادات

6-1- نتيجهگيري636-2- پيشنهادات63فهرست منابع65چکيده انگليسي75
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول1-1- ميکروارگانيسمهاي توليد کننده ليپاز4جدول2-1- آنيونهاي متداول در مايعات يوني19جدول 3-1- محيط کشت Luria Bertani29جدول 3-2- نحوه تهيه محلول TSB30جدول 3-3- نحوه تهيه محلول KCM31جدول 3-4- نحوه تهيه محلول برادفورد34جدول 3-5- نحوه تهيه بافر نمونه 4X37جدول 3-6- نحوه تهيه ژل پلي اکريل آميد37جدول 3-7- نحوه تهيه مخلوط سنجش فعاليت آنزيم38جدول 4-1- فعاليتهاي ليپازي عصارههاي سلولي کلنيهاي 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسيون44جدول 4-2- مشخصات مراحل تخليص TTL.46جدول 5-1- غلظتهاي بهينه مايعات يوني (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC هاي مربوطه58
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1- آنزيم ليپاز ريزوموکور ميهي (PDB entry 3TGL)6شکل 1-2- آنيونها و کاتيونهاي مرسوم در مايعات يوني مورد استفاده در بيوکاتاليز9شکل 1-3- آنزيم CALB در حضور مايعات يوني بدون آب12شکل2-1- ساختارهاي نمونه از کاتيون مايعات يوني معمول در بيوکاتاليز18شکل 3-1- سنتز مايعات يوني با آنيون برميد28شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوي ژن آنزيم TTL42شکل 4-2- بهينه سازي مدت زمان تخليص به روش رسوب دهي دمايي45شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخليص آنزيم TTL46شکل 4-4- تصوير ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخليص آنزيم TTL47شکل 4-5- اثر غلظتهاي مختلف مايعات يوني بر فعاليت آنزيمي48شکل 4-6- نمودار پايداري آنزيم TTL در دماهاي بالا در بافر تريس mM 5049شکل4-7- نمودار پايداري TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهاي °C 85 و °C9050شکل4-8- نمودار پايداري دمايي TTL در مايعات يوني؛ مقايسه اثر نوع آنيون52شکل 4-9- نمودار مقايسه اثر مايعات يوني با طولهاي مختلف زنجيره کربني کاتيون ايميدازوليوم بر پايداري دمايي آنزيم TTL53شکل 4-10- نمودار بررسي اثر نوع کاتيون بر پايداري دمايي آنزيم TTL53شکل 4-11- طيف فلورسانس آنزيم TTL در بافر تريس mM 50 پس از حرارتدهي در °C 8554شکل 4-12- طيفهاي فلورسانس مربوط به آنزيم TTL انکوبه شده در مايعات يوني ايميدازوليومي با آنيون PF655شکل 4-13- طيف فلورسانس آنزيم TTL انکوبه شده در مايع يوني [C4MIM][PF6]55
فصل اول
مقدمه
1-1- آنزيمها
آنزيم ها کاتاليزورهاي زيستي بسيار کارآ هستند که ميتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزايش دهند(Agarwal, 2006). بخشي از زيست توده1 زمين ليپيدها هستند و آنزيمهاي ليپوليتيک2 نقش مهمي در حذف اين مواد نامحلول در آب را دارند. آنزيمهاي ليپوليتيک در شکستن و حرکت دادن ليپيدها درون سلولهاي يک جاندار و انتقال ليپيدها از يک جاندار به جاندار ديگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزيمها مزاياي زيادي در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها ميتوان اختصاصيت بالاي آنها، انجام واکنش در شرايط معتدل، کاهش مواد زائد، تعيين نوع محصول و کاهش محصولات جانبي با انتخاب آنزيم مناسب، کاهش هزينهها و سرمايه لازم در مقياس بزرگ، کاهش اتلاف هزينه در فرآيندهاي آنزيمي، زيست تخريب پذير بودن آنزيمها، کاهش ميزان مصرف کاتاليزور (آنزيم) به ميزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراين سهم آنزيم در3BOD جريان مواد زائد بسيار ناچيز است (Posorske et al., 1984).
آنزيمهاي ميکروبي کارآتر از انواع گياهي و جانوري هستند. آنزيمهاي ميکروبي داراي تنوع عملکردي بالا، بازده بالا، دستورزي ژنتيکي آسان، منبع مشخص (که اين به دليل نبود نوسانات فصلي، رشد سريع باکتري و محيط رشد ارزان قيمت آن ميباشد)، پايداري بيشتر و توليد آسانتر نسبت به انواع گياهي و جانوري هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سريع باکتريها و بنابراين آسانتر بودن فرآيندهاي غربالگري در مورد آنها، باعث تسهيل فرآيندهايي همچون دست ورزي ژنتيکي و ايجاد تغييرات در محيط اطراف سلول، در جهت دستيابي به بيشترين توليد آنزيم، افزايش فعاليت آنزيمي سلولها، ايجاد روند توليد پيوسته يا توليد القايي ميشوند. تنها حدود دو درصد از گونههاي ميکروبي به عنوان منبع آنزيم بررسي شدهاند که در اين ميان سويه هاي باکتريايي به دليل فعاليت بالاتر، pH بهينه خنثي يا قليايي و مقاومت به دما، بيشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).
1-2- ليپازها
ليپازها اولين بار در سال 1901 در باکتريهاي Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهاي امروزي Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسايي شدند (Eijkman et al., 1901). باکتريهاي گفته شده هماکنون بيشترين مطالعات ليپازي را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روي آنزيمهاي هيدروليز کننده تريگليسريدها ميگذرد و حدود 70 سال است که توانايي ليپازها در کاتاليز واکنشهاي هيدروليز و سنتز استرها تشخيص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولين آنزيم ليپاز را (آنزيم تجزيه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شيره پانکراس کشف کرد. انسانها در قديم ليپاز را از پانکراس حيوانات به صورت خالص يا به صورت مخلوط با ساير آنزيمهاي پانکراس ميگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مينمودند. به دليل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوري آنزيم از آن، دانشمندان به سراغ ليپازهاي ميکروبي رفتند. ليپازها از نظر نوع منشأ ( باکتري، قارچ يا پستاندار و غيره) و از نظر خصوصيات متفاوت هستند. اين آنزيمها داراي توانايي کاتاليز واکنشهاي مختلفي از جمله واکنشهاي هيدروليزي4، يا سنتز کربوکسيليکاستر5هاي مختلف و تبديل آنها به اسيدهاي آلي و گليسرول هستند. همه ليپازها اختصاصيت بسيار بالايي براي سوبستراهاي گليسريدي دارند.
آنزيمهاي ليپولايتيک به دليل کاربرد فراواني که در بيوتکنولوژي دارند ( به عنوان مهمترين گروه بيوکاتاليزورها در بيوتکنولوژي)، بسيار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). توليد انبوه ليپازهاي ميکروبي نيازمند بيان شديد و کارآ از ژنهاي مربوطه و فهم دقيق مکانيسم ملکولي نحوه پيچش پروتئين و ترشح آن ميباشد. از جمله کاربردهاي جديد ليپازها در بيوتکنولوژي ميتوان استفاده از اين آنزيم در سنتز بيوپليمر6، بيوديزل7، داروهاي خالص انانتيومري، مواد شيميايي مورد استفاده در کشاورزي ( مانند انواع آفت کش)، ترکيبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسياري از مواد شيميايي مهم صنعتي، به دست آمده از روغنها و چربيها طي فرآيندهاي شيميايي را ميتوان به کمک ليپازها با سرعت بيشتر، اختصاصيت بهتر و در شرايط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزيني8 بالاي ليپازها و اختصاصيت بالاي شيميايي و انانتيومري آنها توجه بسياري از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
ليپازهاي گرفته شده از منابع مختلف باکتري، قارچ، گياه و حيوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصيت به موقعيت پيوند، اختصاصيت به اسيدچرب، پايداري دمايي و pH بهينه و غيره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههاي متعددي از باکتريها، مخمرها و قارچهاي رشتهاي توانايي توليد ليپاز دارند (جدول1) سويه هاي نزديک به هم (از نظر تاکسونومي) ممکن است انواع مختلفي از ليپاز ها را توليد کنند (Sharma et al., 2001).
جدول 1-1- ميکروارگانيسمهاي توليد کننده ليپاز
منشأجنسگونهباکتريBacillusB. megateriumB. subtilisB. thermoleovoransB. thermocatenulatusB. cereusPseudomonasP. putida 3SKP. aeruginosaP. fluorescensP. fragiStaphylococcusS. canosusS. hyicusS. haemolyticusS. aureusS. warneriS. xylosusقارچPenicilliumP. cyclopiumP. simplicissimumAspergillusA. nigerA. oryzaeRhizopusRhizop. delemarRhizop. oryzaeRhizop. arrhizusRhizop. nigricansRhizop. nodosusمخمرCandidaC. rugosaC. tropicalisC. antarctica
ليپازها را ميتوان براساس اختصاصيت به سه گروه تقسيم کرد (Mukherjee et al., 1994). ليپازهاي غير اختصاصي ملکولهاي آسيل گليسرول را در موقعيتهاي تصادفي ميشکنند و اسيدچرب آزاد و گليسرول و منوآسيل گليسرول و ديآسيلگليسرول را به عنوان حدواسطهاي واکنش ايجاد ميکنند. محصولات اين واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتاليزورهاي شيميايي است. در واکنش آنزيمي محصول در اثر دما کمتر تجزيه ميشود و اين به دليل پايينتر بودن دماي واکنش در کاتاليز زيستي است. ليپازهاي اختصاصي به موقعيتهاي 1و3، آزادسازي اسيدچرب از موقعيتهاي 1و3 اسکلت گليسرولي را کاتاليز ميکنند. ليپازهاي داراي اسيدچرب اختصاصي، تنها يک اسيدچرب خاص از ملکول آسيل گليسرول آزاد ميکنند (Macrae et al., 1983). ليپازها همچنين تفکيک انانتيومري ترکيبات کايرال و واکنشهاي استريفيکاسيون، ترانساستريفيکاسيون9، و اينتراستريفيکاسيون10 را کاتاليز ميکنند. اين تواناييهاي متنوع کاتاليز، در شکست چربيها، اصلاح چربيها و روغنها، سنتز ترکيبات آلي، تأمين شويندهها و روشهاي تجزيهاي، کاربرد بسياري پيدا کرده است (Macrae et al., 1985).
1-2-1- ارتباط ساختار آنزيم ليپاز با عملکرد آن
اين خصوصيت ليپازها که در سطح بين فضاي آبدوست و آبگريز عمل ميکنند، وجه تمايز ليپازها از استرازها ميباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولي آنزيمهاي ليپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون ميباشد. اين آنزيمها نيز شبيه سرينپروتئازها داراي مجموعه سه تايي کاتاليتيک باقيمانده نوکلئوفيل- باقيمانده هيستيدين- باقيمانده اسيدي هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرين- هيستيدين- آسپارتات يا به صورت مجموعه سه تايي سرين- هيستيدين- گلوتامات ميباشد (Noble et al., 1993).
جايگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقيماندههاي آبگريز احاطه ميشود. يک ساختار مارپيچ پليپپتيدي همانند يک درپوش مانع از قرارگيري جايگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال ميشود. همچنين محافظت از آنزيم در برابر فعاليت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تايي کاتاليتيک پروتئاز ايجاد شود (Brady et al., 1990). سمتي از درپوش که روبروي جايگاه فعال است بيشتر از زنجيرههاي جانبي آبگريز آليفاتيک تشکيل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بيرون قرار گرفته است.
تغيير جهتگيري ساختار ?- هليکس درپوش همراه با افزايش آبگريزي سطوح نزديک جايگاه فعال و روبروي آن، باعث پديده “فعال شدن در فضاي بينابيني”11 ميشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزيم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهاي آبگريز، اتصال زنجيرههاي آليفاتيک سوبسترا به سطح آبدوست آنزيم، به ويژه در حضور يک لايه آبپوشي، بسيار نامطلوب است. فضاي بينابيني ايجاد شده در دهانه شيار فعال ممکن است به فراهم سازي يک لايه ناکامل آبپوشي در اطراف ملکول ليپاز و در نتيجه تسهيل پيچش زنجيرههاي آليفاتيک ملکول سوبسترا در سطح آنزيم کمک کند (Petersen et al., 1996). پايدارسازي بيشتر ميتواند به کمک محدودههاي الکتروستاتيک موضعي در سطح آنزيم و با ايجاد جاذبه دوقطبي به سمت پيوند C-H (با قطبيت ضعيف) زنجيرههاي جانبي آليفاتيک فراهم شود.
شکل 1-1- آنزيم ليپاز ريزوموکور ميهي12 (PDB entry 3TGL).
آمينواسيدهاي اصلي جايگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.
1-3- آنزيمها در محيط آلي
کليبانو با انجام تعدادي آزمايش ابتدايي و ساده نشان داد که ميتوان از آنزيمها در حلالهاي آلي آبگريز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنين محيطهايي سرعت واکنش به شدت پايين ميآيد (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسياري از ليپازها و همچنين برخي از پروتئازها و آسيلازها بسيار پايدار هستند، به طوري که حتي در حلالهاي آلي بدونآب نيز فعاليت خود را حفظ ميکنند. اين خصوصيت اساس استفاده موفقيتآميز از اين آنزيمهاي هيدرولاز در واکنشهاي غيرهيدرولازي است. از جمله اين واکنشهاي غيرهيدرولازي ميتوان آسيلاسيون الکلها و آمينها با اختصاصيت انانتيومري را نام برد که در صنعت کاربرد زيادي دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محيط آلي، که شامل مايعات يوني13 نيز ميشود، با فعاليت آنزيم غالبا از جنبه حذف آب ضروري آنزيم مورد بررسي قرار ميگيرد. بسياري از آنزيمها براي فعال بودن به يک پوشش آبي کامل نياز دارند، اما تعداد زيادي استثناء نيز وجود دارد مانند ليپاز B کانديدا آنتراکتيکا14 (CALB) که فعاليت خود را حتي پس از خشک شدن با پنتوکسيد فسفر حفظ ميکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتيسيلين که براي فعال ماندن تنها نياز به تعداد اندکي ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزيم دارد (Dolman et al., 1997). بررسي منابع علمي نشان ميدهد که بيان نياز آنزيم به آب در قالب فعاليت آبي (aW ) مرسومتر از بيان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهاي غيرهيدرولازي با آنزيمهاي ليپاز يا پروتئاز ممکن است باعث حفظ يا افزايش فعاليت آنزيمي شود. هرچند چنين محيطهايي هميشه باعث افزايش واکنشهاي جانبي هيدرولازي ميشوند. همچنين اسيد حاصل از اين واکنشها ممکن است باعث کاهش pH و از دست رفتن فعاليت آنزيمي شود.
حلالهايي که به خوبي توسط اين آنزيمها تحمل ميشوند – هيدروکربنهاي آروماتيک و آليفاتيک، اترها، و الکلها (بجز متانول)- فقط به صورت ضعيفي با آنزيم برهمکنش ميدهند و ميتوان حدس زد که اين حلالها کم و بيش فقط براي آنزيم يک فضاي خالي ايجاد ميکنند. تنها الکلها که تشکيل دهنده پيوند هيدروژني هستند ميتوانند ليپازها را غيرفعال کنند. حلالهايي که برهمکنش بسيار قوي با پروتئينها ميدهند، مانند دي متيل سولفوکسيد15 (DMSO) و دي متيل فرمآميد16 (DMF) نيز باعث غيرفعال شدن برگشتناپذير آنزيمها ميشوند. بنابراين آنزيمها برهمکنشهاي قوي با هيچ مادهاي به جز آب را نميتوانند تحمل کنند (Van Rantwijk, 2007).
نامشخص بودن pH در محيط بدون آب يک عامل پيچيده در آنزيمشناسي است. آنزيم توزيع بار الکتريکي (pH ظاهري) را مطابق با آخرين محلول آبي، مثلا بافر ليوفيليز، حفظ ميکند (Zaks and Klibanov 1985). البته pH بهينه ظاهري تحت تأثير نوع حلال و aW تغيير ميکند (Yang et al., 1993). چنين اثرات مشابهي در محيط مايعات يوني نيز قابل انتظار است.
در حقيقت بيشترين اطلاعات درباره رفتار آنزيم در محيط غيرآبي، حاصل از مطالعات آنزيمها در حلالهاي آلي است. اما حلال هاي آلي براي طبيعت زيان آور هستند بنابراين در سالهاي اخير تلاش زيادي در جهت يافتن جايگزين پاکتري براي محيطهاي واکنش انجام شده است.از جمله محلولهاي دوستدار محيط زيست مايعات يوني را ميتوان نام برد که ميتوانند جايگزين حلالهاي آلي شوند.
علاقه عمومي براي افزايش سرعت واکنشهاي آنزيمي در حلالهاي آلي نيز عامل پيشبرنده ديگر به سمت مايعات يوني بوده است. يکي از دلايل کاهش فعاليت آنزيمي در حلالآلي (در مقايسه با محيط آبي) پايدارسازي مواد واکنش دهنده در حلال است (Klibanov et al., 1997). اين اثر که در واقع همان افزايش حلاليت (افزايش Km) است، با به کارگيري غلظتهاي بالاتري از ماده واکنشدهنده قابل جبران است (Halling et al., 2004). بقيه کاهش فعاليت، در حد 1 تا 2 برابر، مربوط به اثر مجموعهاي از عوامل شامل ناپايدار شدن حالت گذار واکنش (Clark et al., 2004)، تغييرات کنفورماسيون و از دست دادن انعطافپذيري ميباشد (Halling et al., 2004, Clark et al., 2004 ). ثابت ديالکتريک پايين محيطهاي آلي معمولي باعث افزايش انرژي حالت گذار شديدا قطبيده در مقايسه با آب ميشود و بنابراين ناپايدار شدن حالت گذار را در پي خواهد داشت (Clark et al., 2004).
1-4- مايعات يوني
از ميان مايعات مختلفي که ميتوان بهعنوان حلال به کار برد تنها تعداد اندکي به طور عمومي مورد استفاده قرار ميگيرند. با معرفي تکنولوژيهاي سبز يک نگراني اصلي، ايجاد جايگزينهاي مناسب براي حلالهاي مخرب است که در صدر جدول مواد شيميايي زيانآور هستند. زيرا اين حلالها در مقادير بالا استفاده ميشوند و به طور معمول مايعات فراري هستند. نمکهاي مرکب17 مايعاتي هستند که فقط يون دارند (مايعات يوني). در صورت انتخاب مواد اوليه مناسب ميتوان مايعات يوني ساخت که در دماي اتاق و در دماي پايينتر از دماي اتاق مايع هستند. مايعات يوني مواد جديدي نيستند. بسياري از آنها سالهاي زيادي است که شناخته شدهاند. براي مثال ميتوان 18[EtNH3][NO3] را نام برد که دماي ذوب 12 درجه سانتيگراد دارد و در سال 1914 معرفي شد. از همان زمان پيشنهاد شد که از مايعات يوني در سنتز شيميايي به جاي حلال استفاده شود. البته تنها در سالهاي اخير تعداد زيادي مقالات در اين زمينه به چاپ رسيده است. برخي خصوصيات فيزيکي ساده مايعات يوني که آنها را به عنوان حلالهاي بالقوه براي سنتز جالب توجه کرده است توسط ولتون بيان گرديده است (Welton et al., 1999):
حلالهاي خوبي براي طيف وسيعي از مواد آلي و غير آلي هستند.
معمولا شامل يونهاي نامتناسبي هستند که امکان قطبيت بالا در آنها را ايجاد ميکند.
طبق مقياس قطبيت نرمال شده که در آن تترامتيل سيلان19 صفر و آب 0/1 در نظر گرفته شده، قطبيت مايعات يوني مرسوم، به طور معمول در محدوده 6/0-7/0 قرار ميگيرد ( مانند فرماميد20 و الکلهاي محلول در آب21 )
(van Rantwijk et al., 2003). همچنين کاهش طول زنجيره آلکيلي متصل به حلقه ايميدازوليوم و اندازه آنيون در مايعات يوني داراي کاتيون ايميدازوليومي، با افزايش قطبيت مايع يوني در ارتباط است (Carmichael and Seddon, 2000). مقدار قطبيت مايع يوني گاهي به دما و حضور آب حساس است (Baker et al., 2002). مايعات يوني به دليل قطبيت بالايي که دارند محيط خوبي براي واکنشهاي شيميايي و بيوشيميايي ايجاد ميکنند. زيرا ميتوانند سوبستراهاي مختلفي شامل ترکيبات آلي قطبي و غيرقطبي و ترکيبات آلي و غير آلي و پليمري را در خود حل کنند.
با تعدادي از حلالهاي آلي غير قابل امتزاج هستند و بنابراين يک جايگزين قطبي غيرآبي براي سيستمهاي دو فازي ميباشند. همچنين مايعات يوني آبگريز را ميتوان به عنوان فاز قطبي غير قابل امتزاج همراه با آب استفاده کرد (Welton et al., 1999).
مايعات يوني فرار نيستند و اين به دليل يوني بودن ماهيت آنها است که فشار بخار ناچيزي دارند. بنابراين ميتوان از آنها بدون ايجاد آلودگي در سيستمهايي با مکش قوي استفاده کرد (Welton et al., 1999).
بنابراين مايعات يوني داراي پايداري دمايي بوده و فاقد فشار بخار ميباشند (Gordon et al., 2001, Brennecke et al., 2001). به علاوه داري خصوصيات استثنائي به عنوان حلال هستند و ميتوانند هر ماده شيميايي را در خود حل کنند. با جايگزين کردن کاتيون، آنيون و اجزاي متصل به آنها، ميتوان خصوصيات اين حلالها را تغيير داد و به اين صورت مايع يوني مناسب براي واکنش خاصي را ايجاد نمود (Brennecke and Maginn, 2001) (شکل 1-3). گرچه هنوز مشخص نيست که مايع يوني چگونه خصوصيات کاتالايتيک آنزيم را تحت تأثير قرار ميدهد، آنزيمها در مايعات يوني مانند [C4MIM][PF6] فعال و به شدت پايدار هستند (Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000, Laszlo et al., 2001).
شکل 1-2- آنيونها و کاتيونهاي مرسوم در مايعات يوني مورد استفاده در بيوکاتاليز.
1-5- بيوکاتاليز در مايعات يوني
دليل تمايل به انجام بيوکاتاليز در مايعات يوني در واقع ميل به جايگزين کردن مايعات يوني غيرفرار به جاي حلالهاي آلي فرار بوده است. هرچند اين واکنشها در محيط طبيعي آنزيم يعني محيط آبي قابل انجام است اما حلالهاي آلي به طور وسيعي همراه با آنزيمها مورد استفاده قرار گرفتهاند تا از اين طريق ميزان حلاليت واکنشگرهاي آبگريز را بيشتر کرده و تعادل واکنش را از سمت هيدروليز به سمت سنتز تغيير جهت دهند. همچنين خصوصيات غيرمرسوم مايعات يوني به عنوان حلال، باعث گسترش روشهاي متعدد جديد و بسيار کارآ شده است (Van Rantwijk et al., 2007).
1-5-1- آنزيمها در مخلوطهاي مايع يوني- آب
در بيوترانسفورماسيون غالبا از مخلوط محيط آلي- آبي براي افزايش حلاليت واکنشدهندهها و محصولات آبگريز استفاده ميشود. پايداري و فعاليت آنزيمها در مخلوطهاي آبي مايعات يوني غالبا براساس اثرات هافميستر22 مورد بررسي قرار ميگيرد. سري هافميستر نوعي دستهبندي يونها است که به ترتيب توانايي آنها در حل کردن و رسوبدهي پروتئينها ايجاد شده است.
اخيرا در حوزه بيوکاتاليز در مخلوطهاي مايع يوني- آب کارهاي زيادي در رابطه با طيف وسيعي از آنزيمها و مايعات يوني انجام شده است. مايعات يوني را به خوبي ميتوان براساس موقعيت قرارگيري يونها، در سري هافميستر به گونهاي مرتب نمود که ترتيبي از پايدارکنندهترين تا ناپايدارکنندهترين (کاسموتروپ23 تا کائوتروپ24) ايجاد شود.
نمک هاي سري هافميستر با ويژگي هاي كاسموتروپيك و کائوتروپيک يونها مرتبط هستند. يونهايي که به شدت آب پوشي ميشوند به کاسموتروپ ها معروفند و آن دسته از يون هايي كه به صورت ضعيف هيدراته مي شوند، كائوتروپ خوانده مي شوند (Lo Nostro et al., 2005). يونهاي حاصل از نمکهاي سري هافميستر به دو گروه تقسيم مي شوند: Salting- out و Salting- in (Kunz et al., 2004). يون هاي out-Salting (آنيون هاي کاسموتروپ مثل فسفات، سولفات وكاتيون هاي كائوتروپيك مثل كاتيون هاي آمونيوم) پروتئين ها را پايداركرده و نيز باعث رسوب آنها مي شوند. در مقابل يون هاي Salting- in (آنيونهاي كائوتروپ مثل آنيون هاي پركلرات، برمايد و كاتيونهاي کاسموتروپ مثل كاتيون ليتيم) پروتئين ها را ناپايدار ميكنند (Kunz et al., 2004). درغلظت هاي پايين نمک (تا سقف 01/0 مولار) يون ها غالبا از طريق برهمکنش هاي الکترواستاتيک روي آنزيم ها تاثير مي گذارند. هنگامي که در غلظت هاي زياد نمک نيروهاي انتشار يا پراکندگي يوني بر پتانسيل الکترواستاتيک پيروز ميشوند، اثر يونهاي هافميستري اهميت پيدا ميکنند (Lo Nostro et al., 2005).
بسياري از آنزيمها به خوبي در طيف وسيعي از مايعات يوني در محيط آبي عمل ميکنند. به سختي ميتوان مايع يوني پيدا کرد که به هيچ عنوان با هيچ آنزيمي سازگاري نداشته باشد. در رابطه با پيشبيني سازگاري آنزيم و مايعات يوني آبي به نظر ميرسد که کائوتروپي و کاسموتروپي نميتوانند به عنوان تنها عوامل پيشبيني کننده استفاده شوند. همچنين بعيد به نظر ميرسد که بتوان سازگاري آنزيم با مايعات يوني را با در نظر گرفتن تعداد محدودي پارامتر همچون قطبيت يا logP تفسير نمود. اين موضوع در مورد حلالهاي ملکولي محلول در آب نيز صدق ميکند (Van Rantwijk et al., 2007).
اساس پيشبيني سازگاري آنزيمها و مايعات يوني آبي را ميتوان اين گونه بيان کرد که پروتئين زماني پايداري خود را از دست ميدهد که يونها يا ملکول هاي حلال اطراف آن با فرم بازشده آنزيم برهمکنش قويتري نسبت به فرم طبيعي آنزيم داشته باشند (Baldwin et al.,1996). چنين برهمکنشهاي ناپايدارکنندهاي ميتوانند حاصل از “Salting in” يونهاي دوگانه دوست روي گروههاي آبگريز فرو رفته درون ساختار پروتئين يا حاصل از برهمکنشهاي قوي آنها با پيوندهاي پپتيدي باشد (Kaar et al., 2003, Lou et al., 2006). از جمله مباحث مهمتري که بايد به خصوص در مورد آنزيمهاي حساس مد نظر قرار داد ميتوان تغييرات pH ايجاد شده توسط يونهاي اسيدي يا قليايي برونشتد و فعاليت آبي ترموديناميکي را نام برد.
1-5-2- فعاليت آنزيمها در شرايط نسبتا بيآب در مايعات يوني
توانايي ليپاز در تحمل مايعات يوني به صورت بيآب يک توانايي عمومي نيست. آنزيم CALB (Schofer et al., 2001) و CRL 25 (Kaar et al., 2003) در طيف وسيعي از مايعات يوني امتزاجپذير با آب، حاوي آنيونهاي MeSO4-26 (Schofer et al., 2001)، NO3- (Kaar et al., 2003)، AcO-27يا lactate- (Sheldon et al., 2002) غيرفعال است. نکته قابل توجه اين است که ليپاز در چنين محيطهايي حل ميشود زيرا حل شدن پروتئين مستلزم شکسته شدن برهمکنشهاي پروتئين- پروتئين و تشکيل اينترکشنهاي قويتر با محيط است (شکل 1-4). آب نيز چنين عملکردي دارد؛ اما حلالهاي آلي مانند N،N- ديمتيل فرماميد28 و ديمتيل سولفوکسيد29 که آنزيمها را در خود حل ميکنند و در ضمن، گروههاي سطح پروتئين را کئوردينه ميکنند، عوامل دناتوره کننده قوي محسوب ميشوند.
به نظر ميرسد که مايعات يوني بدون آب با روشي مشابه حلالهاي آلي مرسوم، آنزيم را تحت تأثير قرار ميدهند؛ زيرا بسياري از آنها به خوبي تحمل ميشوند اما برخي از آنها نيز سازگاري بسيار کمي دارند که البته اين موضوع به نوع آنزيم نيز بسيار وابسته است. براي مثال مايعات يوني حاوي يونهاي AcO- و NO3- که به صورت مخلوطهاي آبي سازگاري بسيار خوبي دارند، در حالت بدون آب آنزيم بسيار مقاوم CALB را غير فعال ميکنند. بر اساس اطلاعات فعلي، مايعات يوني با آنيونهاي BF4- و PF6-، و آنيون مقاوم به هيدروليز NTf2- و آنيونهاي زنجير متوسط آلکيل سولفات به همراه کاتيونهاي ديآلکيلايميدازوليوم و آلکيلپيريدينيوم گزينههاي ايمنتري به نظر ميرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون يک اساس نظري براي پيشبيني سازگاري آنزيمها و مايعات يوني بيآب ايجاد نشده است. هرچند تعدادي از عوامل سهيم احتمالي مانند قابليت کاتيون براي ايجاد پيوند هيدروژني (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکيل نانوساختارهاي متصل به هيدروژن، و گرانروي حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر ميرسد که ميزان هسته دوستي آنيون (Kaar et al., 2003) يا قابليت پذيرش پيوند هيدروژني توسط آن (Sheldon et al., 2002) نيز، حداقل در حالتي که ميل کاتيون براي تشکيل پيوند هيدروژني کم است، ميتواند يکي از عوامل کنترل کننده باشد. در اين مورد يک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنيون H2PO4-30 است که بدون دناتوره کردن ميتواند Cyt C31 را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء ديگر [HOPMIM]32[glycolate] است که با داشتن کاتيون و آنيوني با قابليت بالا در ايجاد پيوند هيدروژني، آنزيمهاي احياکننده را در فرم فعال در خود حل ميکند (Walker and Bruce, 2004).
شکل 1-3- آنزيم CALB در حضور مايعات يوني بدون آب. الف) شکل شماتيک از نحوه برهمکنش مايع يوني با بخشهاي باردار و غيرقطبي آنزيم، ب) ساختار شبيه سازي شده آنزيم CALB در محيط مايع يوني DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقي از سطح آنزيم را نشان ميدهد که زنجيرههاي آليفاتيک حضور دارند و رنگ نارنجي نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزيم هستند (Klahn et al., 2011).
1-5-3- پايداري آنزيمها در مايعات يوني تقريبا بيآب
پايداري (دمايي) آنزيمها (فعاليت در طي زمان) معمولا در محيطهاي آلي به خصوص با فعاليت آبي کم، نسبت به محيطهاي آبي، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مايعات يوني نيز ميتوانند چنين اثري داشته باشند. پايداري آنزيمي تعريف واضحي ندارد و روشهاي متنوعي براي سنجش آن وجود دارد. براي بررسي پايداري در ذخيره سازي، آنزيم در مايع يوني در يک دماي خاص انکوبه شده و ميزان فعاليت باقيمانده در نمونهها که با آب رقيق شدهاند بررسي ميشود. بازيابي فعاليت بالايي از آنزيم در چنين روشي نشان دهنده اين است که تغييرات ايجاد شده در ساختار آنزيم در اين چنين محيط ذخيرهسازي برگشت پذير است. پايداري آنزيم را ميتوان با انکوبه کردن آنزيم در مايع يوني در بازههاي زماني مختلف و سنجش فعاليت در همان محيط بررسي نمود. همچنين ميتوان ساختار آنزيم را با روشهاي اسپکتروسکوپي در محيط مورد نظر بررسي نمود. براي مثال دماي بازشدن ساختار پروتئين شيرين مونولين از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزايش يافت (Baker et al., 2004). نوع ديگر پايداري که ميتوان مورد بررسي قرار داد پايداري در شرايط واکنش است.
بهطور کلي آنزيمها در مايعات يوني فعاليت و ساختار خود را در مدت زمان طولانيتر و در دماهاي بالاتري نسبت به حلالهاي آلي ملکولي حفظ ميکنند. دليل احتمالي اين امر گرانروي بالاي مايعات يوني است که باعث کند شدن حرکت دمينهاي پروتئين از موقعيت خود در فرم فعال پروتئين به موقعيتهاي جديد ايجاد کننده فرم غيرفعال ميشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
1-5-4- آنزيمها، مايعات يوني، پيوندهاي هيدروژني و فعاليت
پيوندهاي هيدروژني عامل پيوستگي ساختار آنزيمهاي آبپوشي شده و بدون آب هستند. هر تغيير ساختاري مستلزم فروپاشي تعداد قابل توجهي از پيوندهاي هيدروژني به طور همزمان ميباشد؛ اين امر سهم قابل توجهي در پايداري آنزيم دارد و گوياي اثرات حافظه آبپوشي 33و اثرات پسماند34 است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند اين است که تعداد ملکولهاي آب متصل به آنزيم تنها وابسته به ميزان فعاليت آبي نيست، بلکه به حافظه آبپوشي نيز مربوط ميباشد.
پژوهشهاي مختلفي نشان داده اند حلالهايي که در شرايط آبي يا غيرآبي با آنزيم سازگارند، مانند استونيتريل يا ترت- بوتيل الکل، در غلظتهاي پايين باعث غيرفعال شدن آنزيم ميشوند (Griebenow et al., 1996). چنين نتايجي را ميتوان در پژوهشهاي انجام شده در مايعات يوني نيز مشاهده کرد. دليل اين امر کاهش اثر آبگريزي در حضور حلال است. در نتيجه پايداري آنزيم کاهش مييابد تا اينکه در يک غلظت مشخص آنزيم غيرفعال ميشود.
پيوندهاي هيدروژني ميتوانند توضيح مناسبي براي پايداري آنزيم در مايعات يوني بدون آب باشند. مايعات يوني، بهخصوص آنيون آنها که پيوندهاي هيدروژني قوي ايجاد ميکنند، ممکن است باعث از بين رفتن پيوندهاي هيدروژني شوند که عامل يکپارچگي ساختار ?- هليکسها و صفحات ? بودهاند و بنابراين باعث باز شدن کل پروتئين يا بخشي از آن شوند. براي مثال يون لاکتات به راحتي ميتواند با اسکلت پليپپتيدي پيوند هيدروژني برقرار کند. اندازه يون نيز ميتواند مهم باشد زيرا يونهاي با اندازه بزرگ براي ايجاد تعداد اندکي پيوند هيدروژني بين خود و آنزيم، نياز دارند که تعداد زيادي پيوند هيدروژني را بشکنند، بنابراين نميتوانند به سادگي پايداري آنزيم را مختل کنند. در آنزيمهايي که به صورت برگشتپذير غيرفعال شدهاند احتمالا پيوندهاي هيدروژني توانستهاند کانفورماسيون را حفظ کنند و در ادامه براي بازيابي ساختار آنزيم لازم است اين پيوندها فروپاشند و پيوندهاي طبيعي دوباره ايجاد شوند. رقيق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مايع يوني دناتوره کننده، ميتواند باعث تشکيل دوباره پيوندها شود احتمالا چنين ترکيباتي که پيوند هيدروژني قوي تشکيل ميدهند با تشکيل پيوندهاي هيدروژني ناپايدار، تشکيل دوباره پيوندها را تسهيل ميکنند.
1-5-5- بيوترانسفورماسيون در محيط مايعات يوني توسط ليپازها و استرازها
کاربرد ليپازها در بيوترانسفورماسيون شامل طيف وسيعي از واکنشهاي سالوولايتيک35( نوعي از واکنشهاي جانشيني هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفيل عمل کرده و جانشين يک اتم يا گروه در ملکول سوبسترا ميشود) مربوط به گروه کربوکسيل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله اين واکنشها ميتوان استريفيکاسيون36، ترانساستريفيکاسيون (الکلوليز37)، پرهيدروليز38، و آمينوليز39 (سنتز آميد) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهاي ترانساستريفيکاسيون و سنتز آميد ترجيحا در محيط بيآب و در حضور زئوليت فعال40، جهت متوقف ساختن واکنشهاي هيدرولازي ناخواسته، انجام ميشود. در اين واکنشها اغلب از آنزيمهايي همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده ميشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتي چنين شرايطي را تحمل ميکنند.
جهت دستيابي به بهينهترين حالت تشخيص انانتيومرها لازم است که محيط واکنش، مايع يوني



قیمت: تومان


پاسخ دهید