بسم الله الرحمن الرحيم
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد گرمسار
دانشكده پزشكي
پايان نامه:
براي دريافت درجه دكتري حرفه‌اي دامپزشكي (D.V.M)
سال تحصيلي: 90 – 1389شماره پايان نامه:
موضوع:
تعيين ميزان آفلاتوکسينB1درکنسانتره ي مصرفي گاوهاي شيري شهرستان گرمسار
استاد راهنما: دکتر مهدي منصوري
استادياربخش قارچ شناسي دانشکده دامپزشکي دانشگاه آزاد گرمسار
استاد مشاور: دکتر ويداپيرزماني
استادياربخش صنايع مواد غذايي دانشکده دامپزشکي دانشگاه آزاد گرمسار
استاد داور: دکتر علي نوري امام زاده
استادياربخش علوم کشاورزي دانشگاه آزاد واحد گرمسار
نگارش:حامدنظري
پاييز89
ISLAMIC AZAD UNIVERSITY
(Garmsar Branch)
Faculty of Veterinary Medicine (D.V.M Thesis)
Years: 2010No:
Subject:
Determination of AFB1 level in concentrate consumption of garmsar milking cows
Supervisor:
Dr.Mehdi Mansouri
Consulting Advisers:
Dr.Vida Pirzamani
Dr.Ali Noori emamzade
By:
Hamed Nazari
Year:2010
سپاسگزاري
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چكيده1
فصل اول: کليات2
1-1- مقدمه و هدف3
1-2- تاريخچه4
1-3- مايكوتوكسين‌ها به عنوان متابوليت هاي ثانويه5
1-4- طبقه‌بندي مايكوتوكسين‌ها6
1-5- خواص عمومي مايكوتوكسين‌ها7
1-6- مهمترين قارچ‌هاي مولد سم11
1-6-1- جنس آسپرژيلوس11
1-6-2- جنس پني‌سيليوم11
1-6-3- جنس فوزاريوم11
1-6-4- ساير جنس‌هاي قارچي12
1-7- مکانيسم اثر مايكوتوكسين‌ها12
1-8- وقوع طبيعي مايكوتوكسين‌ها12
1-9- آفلاتوكسين‌ها14
1-9-1- شرايط توليد16
1-9-2- خواص فيزيكي و شيميايي21
1-9-3- بيوسنتز25
1-10- متابوليسم و تبديل بيولوژيك31
1-10-1- اكسيداسيون31
1-10-1-1- اپواكسيداسيون31
1-10-1-2- هيدروكسيداسيون32
1-10-1-3- دمتيلاسيون33
1-10-1-4- توليد آفلاتوكسين B2a وآفلاتوكسين G2a33
1-10-2- احيا33
1-10-3 الحاق34
1-10-3-1- الحاق گلوكورونيدي اپوكسيد34
1-10-3-2- الحاق مشتقات هيدروكسيله35
1-11- اثرات بيولوژيك 35
1-11-1- سميت حاد و مزمن35
1-11-2- سميت سلولي36
1-11-3- جهش‌زايي 37
1-11-4- ناقص‌الخلقه‌زايي38
1-11-5- تداخل با فرآيندهاي بيوشيميايي38
1-11-6- ميانكش آفلاتوكسين با DNA 39
1-11-7-اثرت حشره کشي40
1-11-8-سميت گياهي40
1-12- بيماري‌هاي دامي‌ ناشي از آفلاتوكسين40
1-12-1بيماري‌زايي آفلاتوكسين‌ها در گاو شيري42
1-13-آسيب شناسي آفلاتوکسيکوز44
1-14-زيانهاي اقتصادي ناشي ازآفلاتوکسين ها47
1-15- حد مجاز مايكوتوكسين‌ها و مقررات مربوطه47
1-16-استراتژي‌هاي خنثي‌سازي و حذف ميزان آفلاتوكسين49
1-16-1- غيرفعال كردن در اثر حرارت50
1-16-2-اشعه دادن50
1-16-3-عصاره‌ گيري با استفاده از حلال و جدا سازي مكانيكي51
11-16-4-جذب آفلاتوكسين از محلول51
1-16-5-كنترل زيستي و غير فعال كردن آفلاتوكسين با بهره‌گيري از ميكروب‌ها51
1-16-6-مجاورت با آمونياك51
1-16-7-بي‌سولفيت سديم52
1-17- آفلاتوكسين‌ها در محصولات كشاورزي 54
1-18- حضور آفلاتوكسين‌ها در فرآورده‌هاي حيواني56
1-19- اثرات سوء آفلاتوكسين‌ها بر سلامتي انسان60
1-20-روش‌هاي آناليز63
1-20-1- روش‌هاي بيولوژيك63
1-20-2- روش‌هاي بيوشيمايي63
1-20-2-1 روش هاي كروماتوگرافي63
1-20-3-روش‌هاي سنجش ايمونولوژيك64
1-20-3-1- راديوايمونواسي64
1-20-3-2-الايزا65
1-20-3-2-1- روش الايزاي متجانس67
1-20-3-2-2- روش الايزا نامتجانس67
1-20-3-2-3- محاسن و معايب الايزاي متجانس و نامتجانس67
1-20-3-2-4- روش الايزاي مستقيم68
1-20-3-2-5- روش الايزاي غير مستقيم68
1-20-3-2-6- روش الايزاي رقابتي نامتجانس مستقيم68
1-20-3-2-7- روش الايزاي غير رقابتي غيرمستقيم69
1-20-3-2-8- روش الايزاي غير رقابتي مستقيم69
فصل دوم: مواد و روش كار70
2-1- مواد و وسايل مورد نياز71
2-2- مواد موجود در كيت آزمايش71
2-3-آماده سازي معرف ها72
2-4- روش كار73
2-4-1- جمع‌آوري نمونه‌ها73
2-4-2- آماده‌سازي نمونه‌ها73
2-4-3- اصول انجام آزمايش73
2-4-4- روش انجام آزمايش74
2-5- روش آناليز آماري75
2-6- قرائت و تفسير نتايج75
2-7- حساسيت وويژگي آزمايش76
فصل سوم:نتايج77
3-1-نتايج78
فصل چهارم:بحث وپيشنهادات80
4-1- بحث و نتيجه گيري81
4-2پيشنهادات 84
منابع فارسي…………………………………………………………………………………….85
منابع انگليسي…………………………………………………………………………………..86
چکيده ي انگليسي………………………………………………………………………………97
فهرست جداول
جدولصفحه
(1-1) خواص فيزيكي و شيميايي انواع مختلف آفلاتوكسين………………………………..24
(2- 1) انتخاب روش‌هاي مناسب براي تخريب انواع آفلاتوكسين در محيط‌ها و شرايط مختلف…………………………………………………………………………………………..53
(3-1) ارتباط بين ميزان سمّ موجود در اغذيه حيواني با سطح نهايي آن در فرآورده‌هاي مربوطه…………………………………………………………………………………………59
(4-1) مراحل اساسي در آناليز شيميايي مايكوتوكسين‌ها …………………………………..62
(5-1) آزمون‌هاي بيولوژيك مورد استفاده جهت ارزيابي سميت مايكوتوكسين‌ها…………66
(1-3) پراکندگي آلودگي به آفلاتوکسين B1در کنسانتره مصرفي در گاوداري هاي شيري گرمسار در سه فصل زمستان،بهار وتابستان ………………………………………………..79
(2-3) مقايسه آفلاتوکسينB1 در کنسانتره مصرفي در گاوداريهاي شيري گرمسار در سه فصل زمستان،بهار وتابستان………………………………………………………………79
فهرست اشكال
شكلصفحه

(1- 1) ساختمان شيميايي مايكوتوكسين‌هاي مهم9
(2-1 ) دما و پتانسيل آب بر روي آسپرژيلوس فلاووس و توليد آفلاتوكسن19
(3-1) مسير بيوسنتز آفلاتوكسينB1 27
(4-1) ژن‌ها و واسطه هاي دخيل در بيوسنتز آفلاتوكسين B128
(1-2) منحني استانداردها76
چکيده
بررسي ميزان آفلاتوکسين در کنسانتره هاي مصرفي گاوهاي شيري شهرستان گرمسار
مايکوتوکسين ها متابوليت هاي ثانويه قارچ هاي رشته اي هستند که در مراحل پاياني رشد قارچ هاي رشته اي توليد مي شوند. آفلاتوکسين ها از مهمترين مايکوتوکسين ها هستند که شامل 1B,2B,1G,2G مي باشند، که توسط گونه هاي آسپرژيلوس فلاووس ، آسپرژيلوس پارازيتيکوس وآسپرژيلوس نوميوس توليد مي شوند.چنانچه شرايط حرارت و رطوبت مناسب باشد اين قارچ ها بر روي سوبستراهاي مناسب مانند دانه هاي غلات و خوراک دام رشد کرده و توليد سم مي کنند.در اين بين آفلاتوکسين 1Bاز همه مهمتر و خطرناکتر مي باشد که با مصرف خوراک آلوده به آن توسط دام شيروار در کبد حيوان متابوليزه شده، و به صورت آفلاتوکسين 1M در شير ترشح مي شود که اگر بيش از حد مجاز باشد، سلامت جوامع بشري را به مخاطره مي اندازد. در اين مطالعه 80 نمونه کنسانتره ي گاو شيري از دامداريهاي مختلف شهرستان گرمسار در سه فصل زمستان،بهار و تابستان بصورت تصادفي اخذ شد و به وسيله ي روش الايزا که روشي سريع و حساسي ميباشد، ميزان آفلاتوکسين 1Bاندازه گيري شد.از ميان 80 نمونه ي مورد بررسي 30 نمونه(37.5%) داراي آلودگي بالاتر از حد مجاز(5ميکروگرم بر کيلوگرم) در محدوده ي 15/6-52/18ميکروگرم بر کيلوگرم را نشان دادند.ميانگين آلودگي در فصل زمستان،ر بهار ورتابستان به ترتيب،99/6،49/4 و 13/3 ميکروگرم بر کيلوگرم بود.بالاترين ميزان آلودگي مربوط به فصل زمستان با52/18ميکروگرم بر کيلوگرم و پايين ترين ميزان آلودگي مربوط به فصل تابستان با 51/1 ميکروگرم بر کيلوگرم بود.مقايسه بين ميزان آفلاتوکسين در فصول زمستان،بهار و تابستان بيانگر اختلاف آماري معني دار بين اين سه فصل مي باشد.
کلمات کليدي:آفلاتوکسين 1B،کنسانتره،الايزا،شهرستان گرمسار
فصل اول
كليات
1-1 مقدمه و هدف
مايكوتوكسين‌ها1 از جمله آلاينده‌هاي محيطي مهم محسوب مي‌شوند كه مي‌توانند بر روي انواع دانه، مغزدانه و ساير اجزاي نباتي توليد شوند. تماس انسان و حيوانات با اين دسته از سموم از طريق خوراكي، استنشاقي و يا تماس مستقيم صورت مي‌گيرد و در اين رابطه، حتي مقادير بسيار ناچيز اين تركيبات مي‌تواند مخاطره‌آميز باشد. قارچ‌هاي مولد سم مي‌توانند بر روي طيف وسيعي از سوبستراها نظير برگ‌ها و ساقه‌هاي درحال رشد، دانه‌ها، ميوه‌ها و محصولات غذايي گياهي و حيواني رشد كرده و سم توليد كنند. با اين حال، برخي سوبستراها براي توليد حداكثر ميزان سم مناسب‌ترند كه علت آن مي‌تواند نوع تركيب شيميايي آن‌ها باشد. در اين رابطه، ويژگي سوبسترا براي قارچ يكي از مهمترين جنبه‌هاي تحقيقات انجام گرفته بر روي مايكوتوكسين‌ها در زمينه‌ي آلودگي اغذيه حيواني و انساني است. قارچ‌هاي مولد مايكوتوكسين‌ قادرند در مراحل مختلف كاشت، داشت، برداشت و انبارداري باعث آلودگي محصولات كشاورزي گردند.
امروزه اكثر مايكوتوكسين‌ها را مي توان در سطح قابل قبولي از لحاظ نيازهاي قانوني، دامپزشكي و پزشكي مورد شناسايي قرار داد.انتخاب روش‌هاي مناسب استخراج و تجزيه براي شناسايي اين دسته از سموم در اغذيه انساني و حيواني، افزودني‌هاي خوراكي، بافت‌ها و مايعات بيولوژيك نظير خون، ادرار و شير حيوانات حائز اهميت مي‌باشد. و اكثر مطالعات در راستاي افزايش حساسيت، دقت و تكرارپذيري و مهم‌تر از همه كاهش زمان آناليز متمركز شده است (5).
در اين راستا در تحقيق حاضر از روش الايزا (ELISA)2 كه هم ساده‌تر از روش‌هاي ديگر، و هم داده‌ها باثبات‌ تر بوده و انحراف معيار نسبتاً پايين‌تري نسبت به روش هاي ديگر دارد استفاده كرديم. با اين روش مي‌توان مقادير در حدود 5 قسمت در بيليون (ppb) از آفلاتوكسين‌ B1 را مستقيماً پس از عصاره‌گيري نمونه (بدون اعمال مرحله‌ي پالايش) مورد شناسايي قرار داد. اين روش در مقايسه با ساير روش‌هاي تعيين كميت به زمان و هزينه كم‌تري نياز دارد(5).
1-2 تاريخچه:
واژه مايكوتوكسين از دو لغت يوناني myke به معناي قارچ و Toxicium به معناي سم گرفته شده است. پيدايش دانش مايكوتوكسيكولوژي3 به سال 1960 همزمان با ارائه گزارش مبني بر شيوع يك بيماري مرموز بين بوقلمون‌هاي جنوب شرقي انگلستان مربوط مي‌شود.
اين بيماري ناشناخته را بيماريX بوقلمون4 ناميدند، كه منجر به مرگ حدود صدهزار بوقلمون جوان و دهها هزار جوجه اردك و قرقاول گرديد. همزمان گزارشات متعددي از مسموميت مشابه در اوگاندا، امريكا و انگلستان در انواع ديگر حيوانات مثل ماهي و جوجه اردك گزارش شد(7).آفلاتوكسين B1 با استفاده از كروماتوگرافي كاغذي از عصاره كلروفرمي دانه‌هاي بادام زميني آلوده جداسازي شد و به صورت يك لكه آبي رنگ زير نور ماوراء بنفش مشاهده گرديد. واژه آفلاتوكسين به دنبال جداسازي و شناسايي اين سم و عامل توليد كننده‌ي آن، يعني آسپرژيلوس فلاووس5، از مواد غذايي آلوده از تركيب اختصار كلمات توكسين و آسپرژيلوس فلاووس به دست آمد.در مراحل بعدي، محققين روش كروماتوگرافي لايه‌ي نازك6 را مورد استفاده قرار دادند و به اين ترتيب، 4 لکه‌ي مجزا و تفكيك شده رؤيت شد. نامگذاري آفلاتوكسين‌هاي طبيعي بر روي صفحه كروماتوگرافي لايه نازك پوشيده از ژل سيليكا به اين صورت انجام گرفت كه دو لكه آبي رنگ فوقاني را از بالا به پايين B1 و B2 ناميدند(B از اول كلمه‌ي Blue گرفته شده است) و دو لكه ي متمايل به سبز تحقيقاتي را از بالا به پايين G1 و G2 نام نهادند( G از اول كلمه‌ي Green اقتباس شده است )(5).
آتروف (Autrup) و همكاران در سال براي اندازه‌گيري آفلاتوكسين در ادرار از روش7 سينكرونوس فلورسنس اسپكتروسكوپي استفاده كردند.ويلد وهمکاران( 1986) روش‌هاي ارزيابي سيستم ايمني را كه داراي حساسيت قالبل توجهي است، براي تعيين ميزان آفلاتوكسين در مايعات بدن انسان به‌كار بردند.
يارک(Iarc) وهمکاران (1988) آفلاتوكسين B1 را در ليست مواد سرطانزاي انساني قرار داد (86).
بر اساس گزارشات سازمان غذا و كشاورزي سازمان ملل متحد (FAO) هر ساله ميليون‌ها تن مواد غذايي در اثر آلودگي با مايكوتوكسين‌ها از بين مي‌رود. لذا در سال 1988 برنامه‌ريزي‌هاي زيادي همراه با كارگروه‌هاي آموزشي براي كنترل بهداشتي مواد غذايي در سرتاسر دنيا صورت گرفت. در سال 1990 بنا به گزارش مركز كنترل بيماري‌ها8 در كشور آمريكا عامل ايجاد بسياري از موارد مسموميت‌هاي غذايي، ميكروب‌ها و قارچ‌هاي بيماري‌زا بوده‌اند.
از سال 1990 روش كروماتوگرافي لايه نازك9 به عنوان يكي از روش‌هاي متداول جداسازي آفلاتوكسين مورد توجه بوده و به منظور تشخيص و تعيين مقادير كمي آفلاتوكسين به كار رفته است. در اين روش ميزان سم بر حسب نانوگرم بر گرم( ng/g )گزارش مي‌شود (10).
1-3 مايكوتوكسين‌ها به عنوان متابوليت‌هاي ثانويه
مايكوتوكسين‌ها به همراه ساير متابوليت‌هاي قارچي نظير آنتي بيوتيك‌ها، آلكالوئيدها10 و نظاير آنها تركيباتي هستند كه در مراحل پاياني رشد قارچ‌هاي رشته‌اي11 به وسيله‌ي سلول‌هاي قارچي توليد مي‌شوند. اين گونه متابوليت‌ها كه تحت عنوان متابوليت‌هاي ثانويه12 شناخته شده‌اند و ظاهراً براي خود سلول‌ قارچي هيچگونه فايده‌اي ندارند. از طرف ديگر، متابوليت‌هاي اوليه13 نظير اسيد‌هاي آمينه، اسيدهاي چرب، قندها، اسيدهاي نوكلئيك‌ و پروتئين‌ها براي تمامي ارگانيسم هاي زنده ضروري هستند. فرآيندهاي متابوليكي كه به توليد متابوليت‌هاي اوليه مي‌انجامند متابوليسم اوليه14 ناميده مي‌شوند، در حالي كه متابوليت‌هاي ثانويه محصولات نهايي متابوليسم ثانويه15 محسوب مي گردند.
متابوليت‌هاي ثانويه از نظر ساختماني تركيبات آلي نسبتاً كوچك داراي ساختماني شيميايي پيچيده محسوب مي‌شوند. اينگونه متابوليت‌ها، به ويژه مايكوتوكسين‌ها را مي توان بر اساس مسيرهاي بيوسنتزي آنها طبقه‌بندي كرد. فرآيندهايي كه به توليد متابوليت‌هاي اوليه و ثانويه مي‌انجامد با واسطه‌ي تعداد اندكي از تركيبات ساده نظير استيل‌كوآنزيم A16، موالونيك اسيد17 و اسيدهاي آمينه صورت مي‌پذيرد(5).
1-4 طبقه‌بندي مايكوتوكسين‌ها:
روش‌هاي مختلفي جهت طبقه‌بندي مايكوتوكسين‌ها به كار گرفته شده است كه در اين ميان، طبقه‌بندي بر اساس مسيرهاي بيوسنتز جامع‌تر از سايرين مي‌باشد. در اين رابطه مايكوتوكسين‌ها در چهار گروه اصلي زير قرار مي‌گيرند:
– مايكوتوكسين‌هاي مشتق از پلي كتايد:
مسير پلي‌كتايد مهمترين مسير بيوسنتز مايكوتوكسين‌ها محسوب مي‌شود كه با واسطه استيل كوآنزيم A انجام مي‌گيرد و به توليد مايكوتوكسين‌هايي نظير آفلاتوكسين، اوكراتوكسين18، پاتولين19، سيترينين20، پني‌سيليك‌اسيد21 و غيره مي‌انجامد(5).
– مايكوتوكسين‌هاي مشتق از موالونات:
ترايكوتسن‌ها مهمترين مايكوتوكسين‌هاي توليد شده از طريق مسير موالونات هستند كه علاوه بر جنس فوزاريوم بوسيله جنس‌هاي ديگر از قارچ‌ها نظير ميروتسيوم، تريكودرما، تريكوتسيوم و سفالوسپورم نيز توليد مي‌شوند.
– مايكوتوكسين‌هاي مشتق از پلي‌پيتيدهاي حلقوي و مشتقات آنها:
در رابطه با مايكوتوكسين‌هاي مشتق از ‌پيتيدهاي چند حلقوي مي‌توان به ايسلندي توكسين، اسپوري دسمين، گليوتوكسين و ارگوتامين اشاره كرد. اين گروه از سموم به دنبال الحاق اسيدهاي آمينه به پيتيدهاي ماكروسيليك و يا تركيبات پلي‌سيليك توليد مي‌شوند.
– مايكوتوكسين‌هاي مشتق از اسيدهاي آمينه و موالونات:
تريپتوفان و احتمالاً ساير اسيدهاي آمينه در تشكيل مايكوتوكسين‌هاي مشتق از اسيد آمينه و موالونات به گروهي از واحدهاي ايزوپرن مشتق شده از موالونات متصل مي شوند و به اين ترتيب، سمومي نظير آفلاترم و راكفورتين C توليد مي‌گردند(5).
1-5- خواص عمومي مايكوتوكسين‌ها
– از نظر ساختماني غالباً هيدروكربن‌هاي حلقوي و به‌ ندرت هيدروكربن‌هاي خطي مي‌باشند.
– اكثراً وزن مولكولي پاييني دارند و به همين دليل، به تنهايي فاقد خاصيت آنتي‌ژنتيك بوده و بالطبع قادر به تحريك سيستم ايمني ميزبان نيستند.
– بر اساس تمايل به بافت هدف، تحت عناوين مختلفي نظير هپاتوتوكسين، نوروتوكسين، نفروتوكسين، ژنيتوتوكسين، كارديوتوكسين، درماتوتوكسين، گاسترو اينتستينال توكسين و غيره نامگذاري شده‌اند(4).
– در مقابل عوامل فيزيكي نظير حرارت، آسياب كردن و ساير اعمالي كه بر روي مواد غذايي خام تا مراحل بسته‌بندي اعمال مي‌گردد مقاوم مي‌باشند.
– جزو مسموميت‌زاهاي بالقوه هستند زيرا تحت شرايط مختلف باعث آلودگي مواد غذايي مي‌شود.
– گروهي از آن‌ها اثرات چندگانه دارند و علاوه بر مسموميت قادر به ايجاد اختلالات مختلف مي‌باشند(2).
1- 1: ساختمان شيميايي مايكوتوكسين‌هاي مهم(5)
ادامه تصوير 1- 1: ساختمان شيميايي مايكوتوكسين‌هاي مهم(5)
1-6 مهمترين قارچ‌هاي مولد سم22
مهمترين جنس هاي فلور قارچ و و مولد سم د رمواد غذايي به شرح ذيل مي باشند كه از اين ميان سه جنس آسپرژيلوس و فوزاريوم وپني سيليوم مهمترين آنها و همچنين مهمترين جنسهاي مولد مايكوتوكسين ها مي باشند.
1-6-1 جنس آسپرژيلوس
گونه هاي اين جنس جزء‌معمول ترين آلوده كننده هاي سوبسترهاي مختلف هستند. تعدادي از گونه هاي اين جنس در انسانها و حيوانات بيماريزا مي باشد. و تعدادي توانايي توليد متابوليت هاي سمي دارند. جنس آسپرژيلوس بوسيله توليد مقدار قابل توجهي از كونيدي هاي تك سلولي كوچک كه منشأ آنها فياليد هايي است كه به طور منظم بر روي رأس متورم كونيديوفور قرار گرفته اند توصيف مي شود.
1-6-2 جنس پني‌سيليوم23
اعضاء متعلق به اين جنس قارچي بوسيله توليد كونيديوم‌هاي تك‌سلولي كوچكي توصيف مي‌شود كه از فياليدهاي قرار گرفته به صورت يك ساختمان قلم‌مو شكل منظم بر روي انتهاي كونيديوفورهاي هوايي منشاء مي‌گيرند. مهم‌ترين سموم توليد شده توسط گونه‌هاي پني‌سيليوم شامل سيتروئوويدين، سيترينين، پاتولين، پني‌سيليك اسيد، سم PR، پني‌ترم A، پاكسيلين و روبراتوكسين هستند(5).
1-6-3 جنس فوزاريوم24
توليد ميكروكونيديوم و كلاميديو سپور انتهايي يا مياني، ميزان رشد و توليد رنگدانه بر روي محيط اختصاصي به همراه شكل و اندازه ماكروكونيديوم در شناسايي گونه‌هاي مختلف اين جنس مورد استفاده قرار مي‌گيرد.گونه هاي متعدد فوزاريوم به علت توليد مايكوتوكسينهاي مختلف معرف شده اند . مهمترين توكسين هاي توليد شده توسط فوزاريوم ها شامل: فومونيزين ها ،‌تريكوتسن ها ( T-2 توكسين، دي اكسي نيوالنون و…) زرالنون ، فوزارينا ،‌و مونيلي فورمين مي باشد(5).
1-6-4سايرجنسهاي قارچي
بسياري از جنس هاي قارچي نظيرآلترناريا1 ،كتوميوم 2،فوما 3،كلاويسپس4 ، كلادوسپوريويم 5وغيره بعنوان جنس هاي با اهميت ازنظرتوليد مايكوتوكسين مطرح مي باشند(5).
1-7 مكانيسم اثر مايكوتوكسين‌ها
به طور كلي مكانيسم اثرات مضر مايكوتوكسين ها بر سيستم‌هاي مختلف را مي‌توان به شرح ذيل خلاصه نمود:
– واكنش متقابل با بيو مولكول‌ها در سطح مولكولي (مانند اتصال و تغيير در ساختار مولكول DNA)
– تداخل آنزيم‌هاي حياتي در واكنش‌هاي آنزيمي
– واكنش متقابل با ماكرومولكول‌ها در سيستم‌هاي بدون ياخته (مانند تاثير بر سنتز RNA)
– تداخل با اجزاي سلولي مانند هسته، غشاء سلولي و يا ميتوكندري
– تداخل در سطح بافت‌ها و ارگان‌ها پس از مجاورت با يگ ارگانيسم زنده
– واكنش متقابل در سطح سلولي (مانند تاثير بر فرآيندهاي متابوليك در كشت‌هاي سلولي حيوانات) (5).
1-8 وقوع طبيعي مايكوتوكسين‌ها
مايكوتوكسين‌ها قادرند به طور مستقيم و يا غيرمستقيم وارد سيستم گوارشي انسان و حيوانات شوند. آلودگي غيرمستقيم اغذيه انساني و حيواني زماني اتفاق مي‌افتد كه اين اغذيه در مرحله‌اي از فرآيند عمل‌آوري به قارچ‌هاي مولد سم آلوده شده باشد، مايكوتوكسين توليد شده در اغلب موارد در محصول نهايي وجود خواهد داشت. آلودگي غلات و دانه‌هاي روغني راه اصلي ورود بسياري از مايكوتوكسين‌ها به زنجيره غذايي انساني و حيواني است. در آلودگي مستقيم، مواد غذايي با قارچ مولد سم آلوده شده و شرايط جهت توليد سم توسط قارچ مهيا مي‌گردد. تقريباً تمامي اغذيه انساني و حيواني در يكي از مراحل توليد، عمل‌آوري25، انتقال و ذخيره‌سازي نسبت به آلودگي قارچي حساس مي‌باشند. در كشورهاي توسعه يافته با حذف قارچ‌هاي سمي از زنجيره غذايي، امكان گسترش سم در اغذيه به حداقل مي‌رسد؛ در حاليكه، در اكثر كشورهاي در حال توسعه اين موضوع معمولاً امكان‌پذير نيست و اغذيه كپك‌زده نظير غلات اغلب بخش اجتناب‌ناپذيري از جيره غذايي روزانه را شامل مي‌شوند. به عنوان نمونه، در بخش‌هايي از آفريقا شيوع سرطان كبد با حضور دائمي آفلاتوكسين‌ها و انواع سموم فوزاريومي مرتبط است. بدون ترديد، مصرف اغذيه آلوده به مايكوتوكسين توسط حيوانات با حضور اين دسته از سموم در بافت‌هاي مختلف و هم‌چنين فرآورده‌هاي حيواني نظير شير همراه خواهد بود. در عمل، تمامي اجزاي اغذيه حيواني و انساني در دوره‌اي از زمان در معرض آلودگي قارچي قرار خواهند گرفت و در اين حالت، ماهيت و وسعت آلودگي با قارچ مولد سم، تعيين‌كننده‌ي حضور يا عدم حضور در محصول خواهد بود. همان‌طور كه در بخش‌هاي قبلي عنوان شد، اگرچه شناسايي قارچ‌هاي آلوده كننده در موارد شيوع مايكوتوكسيكوز واجد ارزش تشخيصي است، نتيجه‌گيري قطعي مستلزم استخراج و شناسايي سم يا سموم احتمالي خواهد بود(5).
1-9 آفلاتوكسين ها
درميان مايكوتوكسين ها ،‌آفلاتوكسين ها26 با توجه به دلايلي نظير سابقه نسبتا طولاني به كارگيري گسترده در تحقيقات تجربي و فراوان قابل ملاحظه در طبيعت به عنوان مشهورترين مايكوتوكسين هاي شناخته شده معرفي مي گردند.
آفلاتوكسين‌ها به وسيله گونه‌هايي از گروه آسپرژيلوس فلاووس27 به نام‌هاي آسپرژيلوس فلاووس، آسپرژيلوس پارازيتيكوس و آسپرژيلوس نوميوس توليد مي‌شوند. اين گونه‌ها انتشار جهاني دارند و باعث آلودگي مواد غذايي مي‌شوند. گونه‌هاي فلاووس و پارازيتيكوس قادر به توليد انواع آفلاتوكسين‌هاي طبيعي همراه با تركيبات وابسته مي‌باشند. لازم به ذكر است كه تمامي سويه‌هاي اين دو گونه قادر به توليد آفلاتوكسين نيستند. در اين رابطه، سويه‌هايي كه توانايي توليد آفلاتوكسين را دارند، سويه‌هاي سمي28 و آن‌هايي كه مولد آفلاتوكسين نيستند، سويه‌هاي غيرسمي29 ناميده مي‌شوند(5).
گزارشاتي مبني بر توليد آفلاتوكسين‌ها توسط ساير قارچ‌ها نظير برخي از گونه‌هاي پني‌سيليوم30 و رايزوپوس31 وجود دارد، ولي هيچ‌كدام از آن‌ها تاييد نشده‌اند اين گزارشات متناقض از آن‌جا منشاء مي‌گيرند كه قارچ‌هاي مختلف تركيباتي با خاصيت فلئورسنت توليد مي‌كنند كه در كروماتوگرافي، حركت نسبي نزديك به حركت نسبي آفلاتوكسين‌ها دارند. البته امروزه‌، تست‌هاي تاييد كننده ساده‌اي در دسترس است كه به راحتي در رفع اين معضل مورد استفاده قرار مي‌گيرند. گونه‌هاي قارچي موجود در گروه آسپرژيلوس فلاووس به عنوان ميكروفلور دائمي32 هوا و خاك مطرح بوده و در ارتباط با گياهان و حيوانات مرده و زنده در سرتاسر جهان يافت مي‌شوند. آسپرژيلوس فلاووس بر روي دانه‌هاي انبار شده و ساير محصولات كشاورزي حضور پيدا كرده و باعث فساد اين تركيبات مي‌شود. سرهاي كونيديال33 در اين‌گونه در محيط چاپكس آگا ر34 در ابتداي رشد به رنگ زرد يا زرد- سبز ديده مي‌شوند كه با گذشت زمان رنگ سبز پررنگي پيدا مي‌كنند؛ با اين حال، هيچ‌گاه به رنگ قهوه‌اي در نمي‌آيند. اسكلروتيا35 در بسياري از سويه‌ها توليد مي‌شود و كونيديوم‌ها خاردار مي‌باشند. استريگماها36 اكثراً در دو رديف توليد مي‌شوند كه بر روي هم قرار مي‌گيرند. سرهاي كونيديال به فرم شعاعي يا در مواردي استوانه‌اي در مي‌آيند. آسپرژيلوس پارازيتيكوس واجد سرهاي كونيديال شعاعي و استريگماي يك رديفه مي‌باشد.گونه پارازيتيكوس به علت دارا بودن خصوصياتي نظير رنگ سبز تيره، رشد آهسته‌تر، كونيديوفورهاي كوتاه، كونيديوم‌هاي متحدالشكل گرد با قطر تقريبي 5/4 ميكرون و غالباً خاردار و زرد رنگ در دستجاتي در داخل ستون‌هاي كونيديال و عدم توليد اسكلروتيا و كليستوتسيا37، از گونه فلاووس متمايز مي‌شود. آفلاتوكسين‌هاي B و G به وسيله‌ي تمامي جدايه‌هاي سمي آسپرژيلوس پارازيتيكوس توليد مي‌شوند؛ در حالي كه اكثر جدايه‌هاي آسپرژيلوس فلاووس صرفاً قادر به توليد آفلاتوكسين‌هاي گروه B هستند. بسياري از جدايه‌هاي داراي مورفولوژي غيرطبيعي در آسپرژيلوس فلاووس و جدايه‌هايي كه از نظر طبقه‌بندي حد واسط گونه‌هاي فلاووس و پارازيتيكوس مي‌باشند نيز توانايي توليد آفلاتوكسين‌هاي گروه B و G را دارند. توليد آفلاتوكسين‌هاي گروه G در آسپرژيلوس فلاووس ممكن است در سلول‌هاي اسكلروتيايي صورت گيرد. همان‌طور كه ذكر شد، آسپرژيلوس پارازيتيكوس هر 4 نوع آفلاتوكسين اصلي شامل B1 و B2 و G1 و G2 را توليد مي كند، در حالي‌ كه آسپرژيلوس فلاووس تنها انواع B آفلاتوكسين اصلي شامل B1، B2 را توليد مي‌كند. به اين ترتيب، زماني كه تنها آفلاتوكسين‌هاي گروه B حضور داشته باشند، مي‌توان آلودگي را به آسپرژيلوس فلاووس نسبت داد و زماني كه آفلاتوكسين گروه B و G حضور داشته باشند، آسپرژيلوس پارازيتيكوس به تنهايي و يا همراه با آسپرژيلوس فلاووس عامل آلودگي است. سويه‌هاي مولد سم معمولاً در شرايط خاص، دو يا سه نوع آفلاتوكسين توليد مي‌كنند كه همواره يكي از آن‌ها نوع B1 مي‌باشد. آفلاتوكسين‌هاي گروه G معمولاًبه ميزان كمتري از انواع گروه B توليد مي‌شوند. آفلاتوكسين‌هاي B2 و G2 (متابوليت هاي دي‌هيدرو آفلاتوكسين) معمولاً همراه با آفلاتوكسين‌هاي B1 و G1 حضور دارند و همواره ميزان آن‌ها کمتر است. علاوه بر اين، سويه‌هاي آسپرژيلوس فلاووس مقادير جزئي از ساير آفلاتوكسين‌ها نظير آفلاتوكسين B2a و G2a (مشتقات 2- هيدروكسي) را نيز توليد مي‌كنند. آفلاتوكسين M1 نيز در محيط كشت بعضي از قارچ‌هاي مولد آفلاتوكسين مورد شناسايي قرار گرفته است. مطالعات مختلف نشان داده است كه آسپرژيلوس فلاووس مي‌تواند توليد آفلاتوكسين‌هاي گروه G (G1 و G2) در آسپرژيلوس پارازيتيكوس را مهار كند. از آن‌جايي كه عمدتاً گونه فلاووس از محصولات غذايي آلوده جدا مي‌گردد و گونه پارازيتيكوس درصد ناچيزي از جدايه‌هاي گروه آسپرژيلوس فلاووس را در اين رابطه شامل مي‌شود، حضور مقادير اندك آفلاتوكسين G1 در نمونه‌هاي آلوده دور از انتظار نيست. با اين حال، اين‌كه آسپرژيلوس فلاووس به تنهايي مسئول آلودگي نمونه‌هايي باشد كه منحصراً واجد انواع B1 و B2 آفلاتوكسين هستند، ضرورتاً نمي‌تواند واقعيت داشته باشد. در نهايت مي‌توان گفت گونه‌هاي مولد آفلاتوكسين گروه آسپرژيلوس فلاووس شامل آسپرژيلوس فلاووس، آسپرژيلوس پارازيتيكوس و آسپرژيلوس نوميوس مي‌باشند كه پروپاگول‌هاي آن ها (كونيديوم، اسكلروتيا و يا ميسليوم) توسط هوا، خاك و يا حشرات بر روي محصولات غذايي انتقال يافته و عامل آلودگي محسوب مي‌شوند(5).
1-9-1 شرايط توليد
آسپرژيلوس فلاووس و آسپرژيلوس پارازيتيكوس در مجموع به عنوان قارچ‌هاي اصلي مولد آفلاتوكسين شناخته شده‌اند. در برخي موارد، توليد آفلاتوكسين اشتباهاً به جنس‌هاي مختلف و گونه‌هاي غير از آسپرژيلوس فلاووس و پارازيتيكوس نسبت داده شده است. به طور كلي، توليد مايكوتوكسين‌ها از جمله آفلاتوكسين‌ها به وسيله فاكتورهاي مختلف نظير ويژگي‌هاي ژنتيكي قارچ‌هاي مولد و محيط فيزيك وشيميايي كه در آن رشد مي‌كنند تحت تاثير قرار مي‌گيرد. توليد هر نوع مايكوتوكسين علاوه بر گونه به سويه قارچ مولد بستگي دارد. در اين رابطه، اگر چه آفلاتوكسين‌ها تنها توسط گونه‌هاي آسپرژيلوس فلاووس و آسپرژيلوس پارازيتيكوس توليد مي شوند، سويه‌هايي از هر دو گونه وجود دارند كه مولد آفلاتوكسين نيستند(5).
به نظر مي‌رسد كه آسپرژيلوس پارازيتيكوس بيش تر در محصولاتي نظير بادام زميني حضور داشته باشد. اين گونه مولد انواع (B1، B2، G1، G2) آفلاتوكسين مي‌باشد. آسپرژيلوس فلاووس بر روي محيط‌هاي آموزشگاهي مختلف و سوبستراهاي طبيعي، به ويژه غلات، رشد كرده و تنها انواع B1 و B2 آفلاتوكسين را توليد مي‌كند. سويه‌هاي هر دو گونه قادر به توليد آفلاتوكسين M1 نيز مي‌باشند. غالباً به دليل تشابه به گونه‌هاي فلاووس و پارازيتيكوس، در بسياري از موارد توليد آفلاتوكسين‌ها را اشتباهاً به آسپرژيلوس فلاووس نسبت داده‌اند، در حاليكه در حقيقت گونه پارازيتيكوس حضور داشته و مسئول توليد سم بوده است. حتي اگر يك سويه قارچي از نظر ژنتيكي توانايي توليد آفلاتوكسين را داشته باشد، ميزان توليد سم به تركيب شيميايي محيط كشت بستگي خواهد داشت. يك محيط كشت ساده كه از تركيب املاح معدني تشكيل شده و منبع كربن آن گلوكز باشد، براي رشد قارچ ها و توليد سم كافي است. مقادير بسيار ناچيزي از آفلاتوكسين در طي فاز تصاعدي رشد در شرايط كشت آزمايشگاهي توليد مي شود و زماني كه برخي فاكتورهاي غذايي به مصرف رسيده و رشد قارچ محدود شده باشد، بيوسنتز سم شتاب خواهد يافت. توليد 200 تا 300 ميلي‌گرم در ليتر آفلاتوكسين در محيط‌هاي كشت مايع نيمه‌ صناعي نظير محيط عصاره مخمر- سوكروز38 (حاوي 2 درصد عصاره مخمر و 15 درصد سوكروز) گزارش شده است. تركيباتي نظير
گلوتاميك اسيد39، آسپارتيك اسيد40، عصاره ذرت41، عصاره مخمر، عناصر كيميايي نظير روي و منگنز و اسيدهاي چرب به ويژه لينو لنيك اسيد42، لينولئيك اسيد43 و سباسيك اسيد44 را به طور قابل توجهي افزايش مي‌دهند. عنصر روي براي به حداكثر رسيدن توليد آفلاتوكسين ضروري است و تقريباً در كليه محيط‌هاي كشت محرك توليد سم، ميزان اين عنصر به همراه فاكتور رطوبت به دقت كنترل مي‌شود. در اين رابطه، معمولاً به 4/0 تا 2 قسمت در ميليون (ppm) از عنصر روي نياز است. علاوه بر نيازمندي‌هاي تغذيه‌اي، پارامترهاي ديگري نظير دما، ميزان رطوبت نسبي45 و فعاليت آب46 نيز توليد آفلاتوكسين را تحت تاثير قرار مي‌دهند. مناسب‌ترين زمان، دما و رطوبت نسبي براي رشد قارچ به ترتيب 1 تا 3 هفته، دماي 25 تا 30 درجه سانتي‌گراد و 88 تا 95 درصد تعيين گرديده است. حداقل فعاليت آب مورد نياز براي رشد آسپرژيلوس فلاووس و آسپرژيلوس پارازيتيكوس به ترتيب در حدود 78/0 (در دماي 43 درجه سانتي‌گراد) و 84/0 (در دماي 25 درجه سانتي‌گراد) مي‌باشد. فعاليت آب، ميزان رطوبت و تركيب شيميايي47 سوبسترا نيز از فاكتورهاي با اهميت در حمايت از رشد قارچ و توليد آفلاتوكسين محسوب مي شوند. آسپرژيلوس فلاووس براي رشد روي غلات نيازمند 18 تا 5/19 درصد رطوبت مي باشد. به طور كلي، با كاهش رطوبت سوبسترا به كمتر از 12 درصد، رشد قارچ و توليد آفلاتوكسين متوقف خواهد شد(5).
مناسب‌ترين درجه حرارت براي رشد آسپرژيلوس پارازيتيكوس حدود دماي 35 درجه سانتي‌گراد است. با اين‌حال، حداكثر توليد آزمايشگاهي آفلاتوكسين هم بر روي محيط هاي صناعي و هم بر روي محيط هاي طبيعي در دماي 25 تا 30 درجه سانتي‌گراد صورت مي‌گيرد و فرآيند توليد سم در حرارت‌هاي پايين‌تر از 5/7 و بالاتر از 40 درجه سانتي‌گراد، متوقف مي‌گردد. نشان داده شده است كه براي توليد آفلاتوكسين در بادام زميني در شرايط خشكسالي، درجه حرارت خاك يك فاكتور بحراني محسوب مي شود. در اين رابطه، در دماي 7/31 درجه سانتي گراد، هيچ گونه سمي توليد نمي‌شود. اين در حالي است كه حداكثر ميزان سم در دماي 9/29 درجه سانتي‌گراد توليد شده و ميزان ناچيزي از سم در دماي 7/24 درجه سانتي گراد قابل رديابي مي‌باشد. تاثير دما بر روي رشد آسپرژيلوس فلاووس و توليد آفلاتوكسين در شكل 2-1 نشان داده شده است(5).
شكل 2-1 : دما و پتانسيل آب بر روي آسپرژيلوس فلاووس و توليد آفلاتوكسين 51)
علاوه بر فاكتورهاي فوق‌الذكر، عوامل بسياري در طبيعت حضور دارند كه بر روي رشد و متابوليسم يك قارچ رشته‌اي تاثيرگذار مي باشند. براي مثال مي‌توان به عوامل ضدميكروبي توليد شده به وسيله ساير ميكروارگانيسم‌ها و يا سوبستراهاي گياهي قارچ‌هاي رشته‌اي اشاره كرد. اگرچه مهار توليد آفلاتوكسين به وسيله برخي تركيبات نظير اسيد سيتريك و اسيد لاكتيك (به ترتيب توسط آسپرژيلوس نايجر و باكتري‌هاي توليد اسيد لاكتيك توليد مي‌شوند) گزارش شده است، برخي تركيبات نظير پروپيونيك اسيد و متابوليت‌هاي قارچي نظير روبراتوكسين B (توليد شده به وسيله پني‌سيليوم پورپوروژنوم) و سرولنين48 (توليد شده به وسيله‌ي سفالوسپوريوم سرولنس49 و اكروسيليندرويوم اريزا50) همگي بيوسنتز آفلاتوكسين را تحريك مي‌كنند.
در رابطه با مهار توليد آفلاتوكسين به وسيله آسپرژيلوس نايجر نشان داده شده است كه در صورتي كه اين قارچ بر روي بادام زميني كلنيزه شود، آلودگي بعدي محصول با آسپرژيلوس فلاووس با توليد آفلاتوكسين همراه نخواهد بود. نتيجه تاثير 13 گونه قارچي بر روي توليد آفلاتوكسين در ذرت نشان داده است كه گونه‌هاي آسپرژيلوس نايجر و تريكودرما ويريده توليد آفلاتوكسين را به نحو مطلوبي مهار مي‌كنند. زماني كه نسبت آسپرژيلوس فلاووس به آسپرژيلوس نايجر بيش از 19 به 1 باشد، آفلاتوكسين قابل رديابي خواهد بود و در صورتي كه اين نسبت به كم‌تر از 9 به 1 برسد، هيچ گونه آفلاتوكسيني توليد نخواهد شد. احتمالاً دليل مهار توليد آفلاتوكسين توسط آسپرژيلوس نايجر، توليد تركيباتي نظير گلوكونيك اسيد51 به وسيله اين قارچ مي‌باشد(5).
برخي ميكروارگانيسم‌ها با توليد آفلاتوكسين توسط گونه‌هاي مولد سم تداخل دارند. در اين رابطه، توليد آفلاتوكسين به وسيله آسپرژيلوس پارازيتيكوس به طور قابل توجهي در حضور آسپرژيلوس كانديدوس52 و آسپرژيلوس چوالير53 مهار مي‌شود و اين در حالي است كه رشد آسپرژيلوس پارازيتيكوس در حضور اين دو دستخوش تغيير نمي‌گردد. ازآن‌جايي كه سويه‌هاي سمي و غيرسمي متعلق به گونه هاي مولد آفلاتوكسين تواماً در محيط حضور دارند ، رخداد واكنش‌هاي متقابل بين آن‌ها امري طبيعي محسوب مي‌شود. از طرفي، پراكندگي كونيديوم‌هاي سويه‌هاي غيرسمي آسپرژيلوس فلاووس در هوا از كونيديوم‌هاي انواع سمي بيشتر است. به همين دليل، به نظر مي‌رسد كه سويه‌هاي غير سمي همان نوع وحشي و سويه‌هاي سمي از نوع جهش‌يافته باشند. علاوه بر عواملي نظير ميكروارگانيسم ها و فاكتورهاي محيطي تاثيرگذار بر قارچ مولد سم و يا محصول، ساختار ژنتيكي گياه ميزبان نيز بر ميزان توليد آفلاتوكسين توسط قارچ تاثيرگذارمي باشد. كوشش‌هايي براي شناسايي تركيبات شيميايي كه باعث كاهش حساسيت گياه به آلودگي با قارچ‌هاي مولد سم مي‌شوند انجام گرفته است و مشخص شده است كه عوامل مسئول مقاومت گياه در برابر اين گونه قارچ‌ها شامل آنزيم‌ها يا پروتئين‌ها و تركيبات مهاركننده با وزن مولكولي پايين54 مي‌باشند كه توسط خود گياه توليد مي‌شوند.
در مجموع، به عنوان يك نتيجه گيري كلي مي‌توان گفت كه فاكتورهاي متعددي رشد قارچ‌هاي مولد سم و توليد آفلاتوكسين را در محيط‌هاي كشت آزمايشگاهي، محصولات كشاورزي و اغذيه انساني و حيواني تحت تاثير قرار مي‌دهند كه توجه به آن ها جهت نيل به اهداف مختلف از جمله كنترل رشد قارچ و توليد سم ضروري به نظر مي‌رسد(5).
1-9-2 خواص فيزيكي و شيميايي
آفلاتوكسين‌ها در گروه تركيبات دي‌فوروكوماروسيكلوپنتنون55 و دي‌فوروكومارولاكتون56 طبقه بندي مي‌شوند. آفلاتوكسين‌هاي B2 و G2 به ترتيب مشتقات دي‌هيدرو57 از انواع B1 و G1 مي باشند. آفلاتوكسين‌هاي B2a و G2a به عنوان متابوليت‌هاي طبيعي آسپرژيلوس فلاووس جداسازي شده‌اند و در حقيقت مشتقات همي‌استال انواع B1 و G1 محسوب مي‌گردند. آفلاتوكسين‌هاي M1 و M2 اولين بار از نمونه ادرار گوسفنداني كه اغذيه آلوده به مخلوط آفلاتوكسين مصرف كرده بودند جداسازي شده و با استفاده از روش كروماتوگرافي لايه نازك از يك ديگر تفكيك و در نهايت، به وسيله روش كروماتوگرافي كاغذي تخليص گرديدند. اين دو متابوليت در حقيقت مشتقات هيدروكسي انواع B1 و G1 مي‌باشند. آفلاتوكسين‌هاي GM1 و GM2 توسط محققين مختلف از نمونه ادرار گوسفند و موش صحرايي و مايع كشت آسپرژيلوس فلاووس جداسازي شده‌اند. آفلاتوكسين‌هاي M2a و GM2a از عصاره مايع كشت آسپرژيلوس فلاووس جداسازي شده‌اند و به ترتيب مشتقات داراي گروه هيدروكسي انواع M1 و GM1 مي‌باشند. آفلاتوكسين B3، كه از آسپرژيلوس پارازيتيكوس جداسازي گرديده است در حقيقت همان پاراسيتيكول جداسازي شده از آسپرژيلوس پاراسيتيكوس مي‌باشد. آفلاتوكسين B3 از طريق هيدروليز حلقه گامالاكتون58 آفلاتوكسين G1 و سپس دكروبوكسيلاسيون آن توليد مي شود. دي‌هيدرو آفلاتوكسين B3 نيز شناسايي شده است كه در حقيقت از آفلاتوكسين G2 مشتق شده است. آفلاتوكسيكول توسط محققين مختلف به عنوان مشتقي از آفلاتوكسين B1 معرفي گرديده است و به دو فرم ايزومري ? و ? وجود دارد. اين دو فرم را مي‌توان با استفاده از روش كروماتوگرافي لايه نازك از يكديگر تفكيك كرد. آفلاتوكسين P1 در اثر متيلاسيون نوع B1 توليد مي‌گردد و در نمونه‌هاي ادرار گونه‌هاي مختلفي از حيوانات مورد شناسايي قرار گرفته است. آفلاتوكسين Q1 به وسيله ميكروزوم‌هاي كبدي در شرايط آزمايشگاهي از آفلاتوكسين B1 توليد مي‌گردد. هر چهار نوع آفلاتوكسين طبيعي (B1، B2، G1، G2) در حلال‌هاي آلي، به ويژه كلروفروم و متانول، حل مي‌شوند. حلاليت اين انواع در آب ناچيز (10 تا 30 ميكروگرم در ميلي‌ليتر) مي‌باشد. آفلاتوكسين B1 وزن مولكولي برابر 312 دالتون دارد و فرمول ساختماني آن C17H12O6 مي‌باشد. اين تركيب در دماي 268 تا 269 درجه سانتي‌گراد بدون ذوب شدن تبخير مي‌گردد و زير اشعه ماوراءبنفش فلئورسنت آبي روشن از خود نشان مي‌دهد. حداكثر جذب نوري اين متابوليت در طول موج‌هاي 223، 265 و 262 نانومتر بوده و بر روي صفحه سيليكاژل در كروماتوگرافي لايه نازك با استفاده از مخلوط كروفروم: متانول (97:3) داراي حركت نسبي برابر 5/0 مي‌باشد. آفلاتوكسين B1 را مي‌توان با استفاده از كلروفرم: متانول (97:3) يا محلول آبي 70 درصد استن از اكثر تركيبات غذايي عصاره‌گيري كرد. انواع مختلف آفلاتوكسين اشعه ماوراءبنفش را در طول موج 362 نانومتر به شدت جذب مي‌كنند و ضريب خاموشي59 آن‌ها در متانول و اتانول متغير مي‌باشد. اين ضريب براي انواع G1 و B2 به ترتيب 17100 و 24000 محاسبه شده است(5). آفلاتوكسين‌هاي مختلف، عليرغم مقاومت بسيار زياد در مواد غذايي انسان و حيوانات، در PHهاي بالاتر از 10 و پايين‌تر از 3 غيرفعال مي‌گردند. اين تركيبات در فرم‌ محلول نسبت به اشعه ماوراءبنفش حساس و به صورت متبلور مقاوم مي‌باشند. تركيبات اكسيدكننده60 و اشعه ماوراءبنفش در حضور اكسيژن باعث غيرفعال شدن آفلاتوكسين‌ها مي‌شوند(5).
جدول1-1: خواص فيزيكي و شيميايي انواع مختلف آفلاتوكسين (5)
آفلاتوكسينفرمول مولكولي
(فرمول بسته)وزن مولكولي
(دالتون)نقطه ذوب
(درجه سانتي‌گراد)جذب نور ماوراء‌بنفش
(ضريب خاموشي)بازتابش
(نانومتر)B1
B2
M1
M2
B2a
M2a
G1
G2
GM1
GM2
G2a
GM2a
B3
Ro
(Aflatoxicol)
P1
Q1C17H12O6
C17H14O6
C17H12O7
C17H14O7
C17H14O7
C17H14O8
C17H12O7
C17H14O7
C17H12O8
C17H14O8
C17H14O8
C17H14O9
C16H14O6
C17H14O6
C16H10O6
C17H12O7312
314
328
330
330
346
328
330
344
346
346
362
302
314
298
328267
306-303
299
293
240
248
259-257
240-237
276
272-270
190
195
217
226-224،I
233،?
320
29521800
23400
19000

20400

16100
21000


18000

9700
14100

-425
425
425



450
450





425


1-9-3بيوسنتز
همان‌‌طور كه ذكر شد، آفلاتوكسين‌ها متابوليت‌هاي ثانويه قارچ‌هاي آسپرژيلوس فلاووس، آسپرژيلوس پارازيتيكوس و آسپرژيلوس نوميوس مي باشند كه طي چند مرحله واكنش آنزيمي در مسيري پيچيده از يك پيش‌ساز پلي‌كتايد توليد مي شوند. بر اساس اطلاعات موجود در رابطه با بيوسنتز آفلاتوكسين B1، نشان داده شده است كه اسكلت اصلي مولكول سم تماماً از واحدهاي استات61 تشكيل شده است. در حقيقت آفلاتوكسين‌ها دكاكتايدهاي مشتق از استات62 مي‌باشند كه از طريق واسطه‌هاي پلي‌هيدروكسي آنتراكينون63 توليد مي‌شوند. اين اطلاعات با به‌ كارگيري پيش‌سازهاي نشاندار شده و قارچ هاي جهش‌يافته‌اي كه بيوسنتز آفلاتوكسين در آن‌ها در مراحل مختلف مسير متوقف شده است به دست آمده است. در ميان تركيبات طبيعي مشتق از پلي‌كتايد، بيوسنتز آفلاتوكسين در مسير طولاني و پيچيده‌اي صورت مي‌گيرد كه نيازمند وقوع فرآيندهاي اكسيداتيو مختلف مي‌باشد (شكل 3-1).
كشف و شناسايي اين مسير ماحصل بيش از 30 سال مطالعه و تلاش دانشمندان مختلف در اين زمينه است. اين‌طور به نظر مي‌رسد كه حداقل 19 فرآورده ژني براي بيوسنتز آفلاتوكسين مورد نياز باشد. از سال 1992 تاكنون، 23 ژن مسئول كاتاليز 12 مرحله آنزيمي در مسير بيوسنتز آفلاتوكسين B1 كلون گرديده و شناساي شده است. به علاوه دو ژن afIR و afIJ نيز مورد استفاده مي‌باشند كه در تنظيم فعاليت ساير ژن‌هاي مسير نقش اساسي ايفا مي‌كنند. (شكل‌هاي 3-1 و 4-1)(5).
در اولين مرحله از بيوسنتز آفلاتوكسين، واحدهاي آغازگر استات64 و واحدهاي گسترش‌دهنده مالونات65 از طريق واكنش‌هاي دكربركسيلاتيو تراكمي كليسون66 در جهت تشكيل واسطه‌اي به نام هگزانوئيل كوآنزيوم A67 به يك‌ديگر متصل مي‌گردند. اين واكنش‌ها توسط آنزيمي به نام اسيد چرب سنتاز كاتاليز مي‌شوند. تمامي اسيد چرب سنتازهاي قارچي شناخته شده حاوي دو زير واحد آلفا (داراي جايگاه‌هاي آسيل‌كريرپروتئين، كتوردوكتاز و كتو سنتاز) وبتا (داراي جايگاه هاي استيل ترانسفراز، انوئيل ردكتاز، دهيدراتاز و مالونيدل پالميتيل ترانسفراز) مي باشند(5).
شكل 3-1: مسير بيوسنتز آفلاتوكسن B1 (5)
شكل 1-4: ژن‌ها و واسطه هاي دخيل در بيوسنتز آفلاتوكسين B1 ؛ نورسولونيك اسيد، AVN: آوروفانين، AVF: آوروفين، VHA: ورسيكونال همي‌استال، VERB: ورسي كلرين A، ST: استريگماتوسيستين، OMST:اُ-متيل استريگماتوسيستين، AFB1 : آفلاتوكسين B1
اولين واسطه پايدار در مسير بيوسنتز آفلاتوكسين دكاكتايدي به نام نورسولورينيك اسيد68 است. اين واسطه يه دنبال متراكم شدن مكرر يك واحد آغازگر استيل كوآنزيم A و 9 واحد گسترش‌دهنده مالونيل كوآنزيوم A توليد مي‌شود و اين توليد از طريق 10 چرخه تراكمي و 2 چرخه احيا با واسطه يك پلي‌كتايد سنتاز صورت مي‌پذيرد. اولين پلي‌كتايد سنتاز مرتبط با بيوسنتز آفلاتوكسين يعني پلي‌كتايد سنتاز A با استفاده از نقشه‌برداري فيزيكي ژن هاي مربوطه در آسپرژيلوس پارازيتيكوس شناسايي گرديده و با كمك روش تخريب ژني69 مورد تاييد قرار گرفته است(5).
نورسولورينيك اسيد واجد رنگ نارنجي روشن است و به همين دليل موتانت‌هايي كه قادر به تبديل اين تركيب نباشند به سادگي قابل شناسايي خواهند بود. اين تركيب با دخالت سه مرحله آنزيمي كه باواسطه آنزيم‌هاي دهيدروژناز70 و مونواكسيژناز71 صورت مي‌گيرد به واسطه ديگري از مسير بيوسنتز يعني آورانتين72 تبديل مي‌شود. در مرحله بعد، آورانتين تحت تاثير فعاليت يك ژن به نام avnA به هيدروكسي آورانتين73 تبديل مي‌گردد. در ادامه، انجام واكنش‌هاي متوالي با توليد تركيبي به نام ورسي كلرين B74 همراه مي باشند. ورسي كلرين B در محل انشعاب در مسير بيوسنتز آفلاتوكسين واقع شده است، به نحوي كه تبديل آن به استريگماتوسيستين75 با توليد آفلاتوكسين B1 همراه است؛ در حالي كه تبديل آن به دي هيدروكسي استريگماتوسيستين76 منجر به توليد آفلاتوكسين B2 مي شود. به عبارت ديگر، مسير بيوسنتز آفلاتوكسين‌هاي B1 و B2 از مرحله ورسي كلرين تفكيك مي شود. بيوسنتز اين دو نوع آفلاتوكسين به طور كامل شناخته شده است، اما منشاء بيوسنتز انواع G1 و G2 كمتر مورد توجه قرار گرفته است. اين طور به نظر مي رسد كه آفلاتوكسين B1 پيش‌ساز احتمالي براي انواع آفلاتوكسين‌هاي G1 و G2 باشد. آفلاتوكسين G1 از طريق مسير استريگماتوسيستين- O – متيل استريگماتوسيستين (پيش‌سازهاي آفلاتوكسين B1) و آفلاتوكسين G2 از طريق مسر دي‌هيدروكسي استريگماتوسيستين دي هيدروكسي- O – متيل استريگماتوسيستين (پيش‌سازهاي آفلاتوكسين B2) توليد مي شوند. تبديل آفلاتوكسين‌هاي B1 و B2 به ترتيب به انواع G1 و G2 در سويه‌هاي قارچي موتانت كه مسير بيوسنتز آفلاتوكسين در آن‌ها در مراحل اوليه متوقف شده است، صورت نمي‌گيرد. اين نتايج م‍ؤيد آن است كه مسير بيوسنتز آفلاتوكسين‌هاي گروه B و G از يک ديگر جدا است. بنابراين آفلاتوكسين B1



قیمت: تومان


پاسخ دهید