معاونت پژوهش و فناوري
به نام خدا
منشور اخلاق پژوهش
باياري‌از خداوند سبحان ‌و‌اعتقاد به‌اين‌که ‌عالم محضرخداست ‌و همواره ‌ناظر بر اعمال ‌انسان و به‌منظور پاس داشت مقام بلنددانش ‌و‌پژوهش ‌و نظر به اهميت جايگاه دانشگاه در اعتلاي فرهنگ و تمدن بشري، ما دانشجويان و اعضاءهيات‌علمي واحدهاي‌دانشگاه‌آزاداسلامي متعهد مي‌گرديم اصول زيررا درانجام فعاليت‌هاي پژوهشي مدنظر قرار داده و از آن تخطي نکنيم:
1- اصل برائت: الترام به برائت‌جويي از هرگونه رفتار غيرحرفه‌اي و اعلام موضع نسبت به کساني که حوزه علم و پژوهش را به شائبه‌هاي غيرعلمي مي‌آلايند.
2- اصل رعايت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هرگونه جانب‌داري غير علمي و حفاظت از اموال، تجهيزات و منابع در اختيار.
3- اصل ترويج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتايج تحقيقات و انتقال آن به همکاران علمي و دانشجويان به غير از مواردي که منع قانوني دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعايت حريم و حرمت‌ها در انجام تحقيقات و رعايت جانب نقد و خودداري ازهرگونه حرمت شکني.
5- اصل رعايت حقوق: التزام به رعايت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهيدگان (انسان، حيوان، نبات) و ساير صاحبان حق.
6- اصل رازداري: تعهد به صيانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد، سازمان‌ها و کشور و کليه افراد و نهادهاي مرتبط با تحقيق.
7- اصل حقيقت جويي: تلاش در راستاي پي‌جويي حقيقت و وفاداري به آن و دوري از هرگونه پنهان سازي حقيقت.
8- اصل مالکيت مادي و معنوي: تعهد به رعايت کامل حقوق مادي و منعوي دانشگاه و کليه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملي: تعهد به رعايت مصالح ملي و در نظر داشتن پيشبرد و توسعه کشور در مراحل پژوهش.
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده‌کشاورزي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد
رشته مهندسي کشاورزي (بيوتکنولوژي کشاورزي)
گرايش کشاورزي
عنوان
توليد موتاسيون در گياه نعناع فلفلي با استفاده از موتاژن EMS
استاد راهنما
دکترسيدکمال کاظمي‌تبار
استاد مشاور
دکترجعفرمسعودسينکي
نگارنده
سعيدقريب بلوک
شهريور 1392

يرفع الله الذي آمنوا منکم والذين اوتوالعلم درجات
قرآن کريم
کارشناسي ارشد آقاي سعيد قريب بلوک با عنوان توليد موتاسيون در گياه نعناع فلفلي با استفاده از موتاژن EMS در جلسه مورخه13/6/92 تحت نظارت شوراي پايان نامه متشکل از استادان زير با درجه و نمره مورد تاييد قرار گرفت.
1- استاد راهنما: دکترسيدکمال کاظمي تبار امضاء
2- استاد مشاور: دکترجعفر مسعودسينکي امضاء
3- داور خارج از گروه: دکترمجيد معصوميان امضاء
دکتر شهرام رضوان بيدختي
معاون پژوهشي دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
سپاسگزاري
مي‌دانم که تشبيه تو به هر چيز دنيوي اشتباه است اما در باور من تو يک کوه استواري و قدرتي که از تو مي‌گيرم قلبم را زنده مي‌کند. قلبي که ترنمي سبز از ابديت حضور تو جاري است و من نبض بودنت را با تمام وجودم حس مي‌کنم. من به خاطر هرآنچه هستم از تو ممنونم.
از اساتيد گرانقدر جناب آقاي دکترسيد‌کمال‌ کاظمي‌تبار و جناب آقاي دکترجعفر مسعودسينکي به خاطر راهنمائي‌هاي و کمک‌هاي بي‌دريغشان سپاس گزارم. از استاد بزرگوار جناب آقاي دکترمجيد معصوميان که داوري اين پايان نامه را پذيرفته‌اند تشکر مي‌کنم. از نماينده تحصيلات تکميلي سرکار خانم آبيار که زحمت اداره جلسه دفاع را متقبل شدند قدرداني مي‌نمايم.
در اينجا از کساني تشکر مي‌کنم که آنچه در حقم کرده‌اند در وصف نمي‌گنجد. از برادر عزيزم جناب آقاي مهندس امين صادقي و سرکار خانم مهندس قلي‌نژاد به خاطر لطف‌هايي که در حق من کرده‌اند بي‌نهايت سپاسگزارم. از سرکار خانم مهندس شاکري نهايت تشکر و سپاس را براي کمک‌ها و همراهي‌هايشان دارم.
فهرست مطالبصفحهعنوان 1چکيده…………………………………………………………………………………………………………………………… فصل اول: مقدمه و کليات21-1 مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………..31-1-1 اهميت موضوع…………………………………………………………………………………………………….41-1-2 فرضيات………………………………………………………………………………………………………………41-1-3 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………….51-2 کليات……………………………………………………………………………………………………………………..51-2-1 گياه شناسي………………………………………………………………………………………………………….61-2-2 نيازهاي اکولوژي………………………………………………………………………………………………….61-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار……………………………………………………………………………………….. 71-2-4 خواص دارويي…………………………………………………………………………………………………….71-2-5 موارد استفاده……………………………………………………………………………………………………….81-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس……………………………………………………………………………………..81-2-7 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….91-2-7-1 انواع کشت بافت گياهي……………………………………………………………………………………101-2-7-2 بررسي اثرات فاکتورهاي مختلف در محيط کشت…………………………………………………101-2-7-3 نمک‌هاي غيرآلي………………………………………………………………………………………………111-2-7-4 ويتامين‌ها………………………………………………………………………………………………………..111-2-7-5 منبع انرژي………………………………………………………………………………………………………111-2-7-6 ميواينوسيتول……………………………………………………………………………………………………121-2-7-7 عوامل فيزيکي………………………………………………………………………………………………….121-2-7-8 ريزنمونه………………………………………………………………………………………………………….121-2-7-9 چگونگي انتخاب محيط کشت…………………………………………………………………………..131-2-7-10 ريزازديادي گياهان از طريق کشت بافت……………………………………………………………131-2-7-11ريشه‌زائي……………………………………………………………………………………………………….141-2-8 تعريف موتاسيون (جهش) ……………………………………………………………………………………صفحهعنوان 141-2-8-1 تاريخچه استفاده از موتاسيون…………………………………………………………………………….151-2-8-2 سطوح ايجاد موتاسيون……………………………………………………………………………………..151-2-8-3 انواع موتاسيون…………………………………………………………………………………………………161-2-8-4 موتاژن (عامل جهش‌زا) ……………………………………………………………………………………161-2-8-4-1 انواع موتاژن………………………………………………………………………………………………..161-2-8-4-2 عوامل شيميايي جهش‌زا………………………………………………………………………………..181-2-8-4-3 مواد گياهي مورد تيمار………………………………………………………………………………….181-2-8-4-4 اصلاح به روش موتاسيون……………………………………………………………………………..191-2-8-4-5 اهميت موتاسيون در اصلاح نباتات. ……………………………………………………………….191-2-8-4-6 موفقيت موتاسيون………………………………………………………………………………………..191-2-8-4-7 روش‌هاي جديد استفاده از موتاسيون……………………………………………………………..201-2-8-4-8 هدف موتاسيون مصنوعي………………………………………………………………………………211-2-9 روغن‌هاي اسانس…………………………………………………………………………………………………221-2-9-1 جداسازي و شناسايي مواد تشکيل دهنده روغن اسانسي گياه…………………………………فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده232-1 کشت بافت……………………………………………………………………………………………………………..242-2 اثر موتاژن‌ها در ايجاد تنوع در صفات مختلف………………………………………………………………262-3 اثر موتاسيون اتيل متيل سولفانات در ايجاد تنوع در سطوح مختلف…………………………………فصل سوم: مواد و روش‌ها323-1 مواد گياهي………………………………………………………………………………………………………………323-2 کشت بافت……………………………………………………………………………………………………………..323-2-1 تهيه محلول ذخيره محيط‌هاي کشت……………………………………………………………………….333-2-1-1 تهيه محلول ذخيره ماکرو…………………………………………………………………………………..343-2-1-2 تهيه محلول ذخيره عناصر ميکرو………………………………………………………………………..343-2-1-3 تهيه محلول ذخيره آهن-سديم…………………………………………………………………………..353-2-1-4 تهيه محلول ذخيره ويتامين………………………………………………………………………………..353-2-2 تهيه محيط کشت………………………………………………………………………………………………….صفحهعنوان363-2-3 ضدعفوني نمونه‌هاي گياهي…………………………………………………………………………………..363-2-3-1 ضدعفوني اندام گياه………………………………………………………………………………………….373-2-4 تهيه ريزنمونه……………………………………………………………………………………………………….373-2-5 بهينه سازي محيط کشت……………………………………………………………………………………….373-2-6 بررسي نمونه‌هاي کشت شده…………………………………………………………………………………383-2-7 تيمارهاي مورد استفاده………………………………………………………………………………………….383-2-7-1 روش تهيه استوک EMS …………………………………………………………………………………393-2-7-2 روش اعمال تيمارهاي EMS در گياه کشت بافتي……………………………………………….393-2-7-3 روش اعمال تيمارهاي EMS در مزرعه……………………………………………………………..393-2-7-4 روش شستشوي تيمارها……………………………………………………………………………………403-3 استخراج مواد موثره گياهي………………………………………………………………………………………..403-3-1 روش‌هاي استخراج اسانس…………………………………………………………………………………….403-4 آناليز اجزاء اسانس……………………………………………………………………………………………………413-5 آناليزهاي آماري………………………………………………………………………………………………………. فصل چهارم: نتايج و بحث 424-1 بررسي نمونه‌هاي کشت بافتي…………………………………………………………………………………….454-2 تاثير EMS برروي خصوصيات مرفولوژيکي گياه………………………………………………………..464-2-1 اثر دوز EMS و زمان برروي طول ساقه…………………………………………………………………474-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروي طول ريشه………………………………………………………………..474-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد برگ………………………………………………………………..484-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد ريشه جانبي……………………………………………………..494-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد جوانه………………………………………………………………504-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروي متوسط طول برگ………………………………………………………514-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد ريشه……………………………………………………………….514-3 ضريب همبستگي بين صفات و خصوصيات مورد بررسي……………………………………………..524-4 استخراج اسانس……………………………………………………………………………………………………….524-4-1 آناليز و شناسايي کمي و کيفي اجزاي موجود در اسانس…………………………………………….صفحهعنوان534-4-2 نتايج آزمايشگاهي…………………………………………………………………………………………………534-4-3 نتايج مربوط به طيف کروماتوگرام گازي گياه…………………………………………………………..544-4-4 ترکيبات تشکيل دهنده اسانس……………………………………………………………………………….. فصل پنجم: نتيجه‌گيري555-1 بحث………………………………………………………………………………………………………………………555-1-1 کشت بافت گياهي………………………………………………………………………………………………..565-1-2 اثرات موتاژن EMS ……………………………………………………………………………………………605-2 نتيجه‌گيري………………………………………………………………………………………………………………615-3 پيشنهادات……………………………………………………………………………………………………………….62فهرست منابع فارسي………………………………………………………………………………………………………..64فهرست منابع انگليسي……………………………………………………………………………………………………..71پيوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………..75چکيده انگليسي……………………………………………………………………………………………………………….
فهرست جداولصفحهعنوان جدول33جدول 3-1 ترکيبات محيط کشت پايه MS…………………………………………………………………….34جدول 3-2 جدول عناصر پرمصرف MS با غلظت X10…………………………………………………34جدول 3-3 جدول عناصر کم مصرف MS با غلظت X100…………………………………………….35جدول 3-4 محلول ذخيره آهن، ويتامين و اسيدهاي آمينه با غلظت X100………………………….41جدول 3-5 شرايط دستگاه GC-MS……………………………………………………………………………46جدول 4-1 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي طول ساقه گياه نعناع فلفلي…47جدول 4-2 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي طول ريشه گياه نعناع فلفلي..47جدول 4-3 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد برگ در ساقه گياه…….48جدول 4-4 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد ريشه جانبي گياه………49جدول 4-5 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد جوانه گياه……………….50جدول 4-6 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي متوسط طول برگ……………..51جدول 4-7 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد ريشه گياه………………..52جدول 4-8 ضريب همبستگي بين صفات و خصوصيات مورد بررسي در گياه نعناع فلفلي……53جدول 4-9 درصد اسانس و روش استخراج……………………………………………………………………54جدول 4-10 ميزان مواد موثره موجود در اسانس نعناع فلفلي…………………………………………….
فهرست شکل‌ها و پيوست‌هاصفحهعنوان شکل5شکل 1-1 شمائي از گياه کامل نعناع فلفلي……………………………………………………………………..17شکل 1-2 ساختار شيميايي مواد جهش‌زا………………………………………………………………………..53شکل 4-1 کروماتوگرام گازي اسانس نعناع فلفلي…………………………………………………………….58شکل 5-1 نماي از مراحل تاثير EMS برروي گياه کشت بافتي…………………………………………59شکل 5-2 مراحل رشد گياهان مورد تيمار موتاژن در محيط کشت…………………………………….59شکل 5-3 تيمار اعمال شده در مزرعه…………………………………………………………………………….71شکل الف-1 مراحل ضدعفوني گياه……………………………………………………………………………….71شکل الف-2 تهيه ريزنمونه……………………………………………………………………………………………72شکل الف-3 مراحل انجام کار در اتاقک کشت………………………………………………………………..72شکل الف-4 نماي از دستگاه انکوباتور…………………………………………………………………………..72شکل الف-5 اعمال EMS در محيط کشت…………………………………………………………………….75شکل الف-6 اعمال EMS در مزرعه……………………………………………………………………………..73شکل الف-7 شستشوي تيمارهاي کشت بافتي از EMS…………………………………………………..73شکل الف-8 شستشوي بوته‌هاي تيمار شده در مزرعه………………………………………………………74شکل الف-9 نماي از بوته‌هاي تيمار شده در مزرعه…………………………………………………………74شکل الف-10 مراحل اسانس‌گيري………………………………………………………………………………..74شکل الف-11 نماي از دستگاه روتاري…………………………………………………………………………..
فهرست نمودارهاصفحهعنوان نمودار42نمودار4-1 طول ساقه…………………………………………………………………………………………………..43نمودار4-2 طول ريشه…………………………………………………………………………………………………..43نمودار4-3 تعداد برگ در ساقه………………………………………………………………………………………44نمودار4-4 تعداد ريشه جانبي………………………………………………………………………………………..44نمودار4-5 تعداد جوانه در ساقه…………………………………………………………………………………….45نمودار4-6 متوسط طول………………………………………………………………………………………………..46نمودار4-7 اثر غلظت EMS برروي طول برگ در گياه نعناع فلفلي……………………………………48نمودار4-8 اثر غلظت EMS برروي تعداد برگ در ساقه گياه نعناع فلفلي…………………………..49نمودار4-9 اثر غلظت EMS برروي تعداد ريشه جانبي گياه نعناع فلفلي…………………………….50نمودار4-10 اثر غلظت EMS برروي تعداد جوانه گياه نعناع فلفلي…………………………………..
فهرست علامت‌ها و اختصارها
معادل فارسيمعادل انگليسيعلامتاتيل متيل سولفاناتEthyl Methane SulfonateEMSکروماتوگرافي گازي توام با طيف سنجي جرميGas Chromatography Mass SpectroscopyGC-MSاتيل اتان سولفاناتEthyl Ethane SulfonateEESبنزيل آدنينBenzyladenineBAبنزيل آمينوپورينBenzylaminopurineBAPايندول-3- استيک اسيدIndole3-acetic acidIAAايندول-3- بوتيريک اسيدIndole3-butric acidIBAنفتالين استيک اسيد1-Naphthaleneacetic acidNAA
چکيده
نعناع فلفلي با نام علمي Mentha piperitaيکي از انواع گياهان دارويي مي‌باشد که به دليل توليد اسانس‌هاي با ارزش در صنايع داروسازي و بهداشتي استفاده‌هاي فراواني دارد. استفاده از مواد موتاسيون‌زا از قبيل EMS مي‌تواند تغييرات جهش‌زاي نقطه‌اي در گياه ايجاد کند که در نهايت منجر به ظهور فنوتيپ جديد در اين گياه با ارزش شويد. لذا اين پژوهش با انجام تيمارهاي متعدد از غلظت‌هاي مختلف EMS روي سرشاخه‌هاي رشد يافته در محيط کشت MS بدون هورمون و با غلظت‌هاي 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% از EMS و مدت زمان‌هاي مختلف (24 و48 ساعت) و همچنين در قسمت مزرعه‌اي نيز از همين غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد. ارزيابي‌ در داخل لوله آزمايش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه‌ها در شرايط in vitro، تيمارها با ماده جهش‌زا اتيل متان سولفانات مورد بررسي قرار گرفتند. فاکتورهاي مختلف مورفولوژيکي از قبيل طول ساقه و تعداد ريشه رونده جانبي در سطح 1% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح 5% پاسخ معني‌داري را نشان دادند. نتايج اين پژوهش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محيط کشت MS نقش بسزايي در تغيير فنوتيپي اين گياه دارويي دارد. غلظت 01/0% EMS بهترين نتيجه معني‌دار را در سطح 1% و از کشت ريزنمونه‌هاي که شامل جوانه‌هاي جانبي و انتهايي بوده‌اند به‌دست آورده که برروي خصوصياتي همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبي اثر داشت. آناليز اسانس تيمارها نيز انجام شد که نتيجه آن بي‌اثر بودن اين ماده اتيل متان سولفانات روي مواد اجراء اسانس اين گياه بوده است.
کلمات کليدي: اتيل متيل سولفانات (EMS)، اجزاء اسانس، کشت درون شيشه‌اي، محيط کشت MS، نعناع فلفلي (Mentha piperita).
فصل اول
مقدمه و کليات

1-1 مقدمه:
گياهان به عنوان يکي از اجزاء طبيعت، از ديرگاه پشتوانه غني نيازهاي بشري بوده‌اند و مي‌توان با اطمينان گفت تا زماني که انسان در اين کره خاکي به سر مي‌برد، به گياهان نياز دارد (سليمان زاده، 1377).
در بحث گياهان دارويي، محدوديت‌هاي کاشت و نگهداري آن‌ها متعدد مي‌باشد که از آن جمله مي‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و يا برداشت بعضي از گونه‌هاي گياهي، کمبود زمين‌هاي مناسب جهت داشت، ناچيز بودن مواد موثره حاصل از گياه و غيره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوي، 1385).
يکي از راه‌هاي رفع اين محدوديت‌ها کشت بافت گياهي1 است. تکنيک‌هاي کشت بافت گياهي درحال حاضر به عنوان يک ابزار قوي جهت رفع مشکلات اساسي و کاربردي بيولوژي گياهي درآمده است.
استفاده از گياهان به عنوان دارو از زمان‌هاي خيلي دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود يک سوم داروهاي مورد استفاده داراي منشاء گياهي مي‌باشند. کشورهاي آسيايي بخصوص هند، چين و ايران سابقه بسيار طولاني در اين زمينه دارند. اين گياهان مواد زيستي بخصوص و فعال با مقادير بسيار کم توليد مي‌کنند که تحت عنوان متابوليت‌هاي ثانويه نام‌گذاري مي‌شوند. در عصر جديد، دانشمندان علوم گياهي با استفاده از آخرين تکنيک‌هاي عملي کشت بافت گياهي، توانسته‌اند از انواع گياهان ترکيب‌هاي بسيار مفيدي را جهت مداواي بيماري‌هاي سخت و غير قابل مداوا و موارد استفاده ديگر، بدست آورند. در طي چند دهه اخير روش‎هاي متفاوتي با استفاده از بيوتکنولوژي2 درزمينه پرورش محصولات گياهي برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها مي‌توان روش‌هاي ايجاد گونه‌هاي جهش يافته3 و پلي پلوئيد4 را نام برد.
گياهان دارويي فراواني در کشور ما مي‌رويند که بسياري از آن‌ها از جمله نعناع فلفلي داراي طيف وسيعي از خواص دارويي مي‌باشند. برهمين اساس بررسي و مطالعه گياهان دارويي ايران با استفاده از ابزارهاي امروزي ضروري به نظر مي‌رسد. کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شيشه‌اي5 و يا کشت استريل نيز مطرح مي‌شود، ابزاري مهم در مطالعات پايه و کاربردي بوده و داراي کاربردهاي تجاري است (رجب‌بيگي و همکاران، 1385؛ سونانداکوماري و همکاران6، 2003). يکي از اين کاربردها امکان ايجاد گياهان ترانسژنيک با وارد کردن DNA تقريبا از هر منبع ديگري مي‌باشد. شايد اولين قدم در زمينه کشت بافت گياهي در سال 1756 توسط هنري لوئيس داهامل برداشته شد، زماني که وي شاهد تشکيل کالوس7 در حين مطالعه مواد التيام دهنده زخم‌هاي گياهي بود (غضنفري8، 1994).
اساس تئوري کشت بافت گياهي توسط گتليت هابرلنت از آکادمي علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمايش‌هاي وي روي کشت تک سلول‌ها پيشنهاد گرديد (هابرلنت9، 1902). توسعه روش‌هاي کشت بافت و زيست‌شناسي مولکولي براي تبادل DNA بين موجودات زنده غير خويشاوند اين امکان را مي‌دهد که ژن‌هاي جديدي از موجودات زنده خارج از سلسله گياهي به درون گياهان گيرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر مي‌تواند کمکي جهت بررسي و واکنش‌هاي گياه نعناع فلفلي نسبت به تکنيک‌هاي مختلف کشت بافت و باززائي اين گياه از طريق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائي همچون اتيل متان سولفانات10 (EMS) باشد، تا محققين ديگر بتوانند به مطالعه خواص دارويي يا تغييرات لازم در مواد موثره يا فعال (متابوليت‌هاي ثانويه) و يا مطالعات انتقال ژن در اين گياه بپردازند.

1-1-1 اهميت موضوع
براي انجام کشت بافت نعناع فلفلي (Mentha piperita) از بخش‌هاي مختلف گياه مانند ريشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماري و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران11، 2011). با توجه به اينکه روش معمول اصلاح و بهبود توليد متابوليت‌هاي ثانويه در گياهان دارويي شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج اين مواد به روش‌هاي شيميايي و غيره با مشکلات متعددي نظير شرايط محيطي و زراعي، صرف زمان، هزينه و استفاده نيروي کار زياد و همچنين خطرنابودي برخي از گياهان دارويي کمياب روبرو است، استفاده از روش‌هاي نوين از جمله کشت درون شيشه‌اي (in vitro) ضرورت مي‌يابد به همين منظور اولين بار در سال 1976 توسط زنيک تکنيک کشت سوسپانسيون سلول‌هاي گياهي حاوي متابوليت‌هاي ثانويه انجام گرفت. البته در ارتقاء بيوسنتز متابوليت‌هاي دارويي در شرايط درون شيشه‌اي اغلب، گياهاني انتخاب مي‌شوند که بازده توليد متابوليت‌هاي با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقري و صفاري، 1387).
نعناع فلفلي به عنوان يک گياه دارويي شناخته مي‌شود (اميدبيگي، 1384،1389). تاکنون مطالعات زيادي در مورد تعيين مواد موثره نعناع فلفلي صورت گرفته است (کاظم الوندي و شريفان، 1388). موارد مصرف و خواص دارويي آن نيز به خوبي مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ايجاد جهش زياد نبوده است. با توجه به اينکه تکثير اين گياه از طريق بذر مشکل است (بدليل بذور کم و نابارور)، بهترين و سريع‌ترين راه براي داشتن گياه جهت مصارف صنعتي، کشت بافت است. همچنين با در نظر گرفتن اهميت و خواص دارويي اين گياه، مطالعات کشت بافت و بهينه‌سازي محيط کشت جهت اهداف مختلف براي اين گياه ضرورت دارد.

1-1-2 فرضيات
1- کشت بافت يکي از راه‌هاي سريع در ازدياد انبوه نعناع فلفلي مي‌باشد.
2- نعناع فلفلي در محيط کشت همواره در دسترس براي اعمال هر گونه اعمال تيمار از قبيل جهش مي‌باشد.
3- ايجاد جهش نقطهاي تا چه ميزاني مي‌تواند بر روي مواد موثره و ميزان اسانس تغيير ايجاد نمايد.

1-1-3 اهداف پژوهش
1- آشنايي با تکنيک کشت بافت گياه دارويي نعناع فلفلي و تکثير آن در داخل شيشه.
2- بدست آوردن مقدار قابل توجه گياه در حال رشد براي اعمال جهش نقطه‌اي در نعناع فلفلي.
3- بررسي تغيير در ميزان مواد موثره گياه در غلظت‌هاي مختلف ماده جهش‌زاي EMS

1-2 کليات
1-2-1 گياه شناسي
نعناع فلفلي با نام علمي Mentha piperita L. و بـا نـام عمومي Peppermint ازخانواده نعناعيان يک گياه علفي چند ساله است که در رده‌بندي گياهي از تيرهLamiaceae راسته Lamialse و رده Rosidae مي‌باشد (فوستر12، 1996؛ پيرس13، 1999). برگ‌هاي آن بيضوي ، متقابل ، نوک تيز ، دندانه‌دار کمي پوشيده از کرک به درازاي ?-? سانتي‌متر و به عرض ?-? سانتي‌متر است (فلمينگ14، 1998). گل‌ها کامل نامنظم، اکثراً دوجنس يا هرمافروديت و مجتمع به صورت گروهي در روي ساقه و در انتهاي ساقه ظاهر مي‌شوند گل‌ها در ماه‌هاي مرداد و شهريور ظاهر مي‌شوند (اميدبيگي، 1384،1389). رنگ آنها گلي روشن يا کم و بيش ارغواني مايل به بنفش مي‌باشد و به تعداد زياد نيز در مجاورت يکديگر به نحوي مجتمع مي‌شوند که مجموعاً در قسمت انتهاي ساقه‌ها ، به صورت سنبله‌هايي با شکل ظاهري، بيضوي و نوک تيز جلوه مي‌کند (شکل1-1). برخي از شاخه‌هاي اين گياه عقيم و عاري از گل باقي مي‌ماند. عمر گل‌ها بسيار کوتاه و مدت کمي پس از تشکيل از گياه جدا مي‌شود، ميوه کپسول ، کوچک و به رنگ قرمز تيره است (اميدبيگي، 1384،1389).

شکل1-1شمائي از گياه کامل نعناع فلفلي

از جمله ويژگي‌هاي تشريحي نعناع فلفلي، کرک‌هاي ترشحي اسانس در آن‌ است که داراي پايه يک يا چند سلولي منتهي به يک برجستگي ? تا ? سلولي و حتي بيشتر مي‌باشد . اسانس ترشح شده نيز معمولاً خارج از جدار سلولزي ، در زير کوتيکول جمع مي‌گردد و اين خود باعث مي‌شود که بشره در همان ناحيه کمي متورم جلوه نمايد (اميدبيگي، 1384،1389).
اسانس گياه نعناع فلفلي در ابتداي رويش گياه در غده‌هاي پيکررويشي گياه ساخته و ذخيره مي‌شود . تعداد کل غده از حدود ??? غده براي برگ‌هاي به طول ? ميلي‌متر تا حدود ???? غده براي برگ‌هاي ?? ميلي‌متري نعناع فلفلي متغير است. برگ‌ها ? تا ?/? درصد و گل‌ها ? تا 6درصد اسانس دارند. ساقه‌ها معمولاً فاقد اسانس مي‌باشند. به‌طور متوسط مقداراسانس در اندام‌هاي هوايي گياه ? تا 5/1 درصد گزارش شده است (اميدبيگي، 1384،1389).

1-2-2 نيازهاي اکولوژيکي
نعناع فلفلي در طول دوره رويش به هواي نسبتا گرم و تابش نور کافي نياز دارد. در طول دوره رويش نياز به آب کافي دارد. اين گياه در مناطقي كه داراي زمستان‌هاي ملايم (حداقل دما 8 – درجه سانتي‌گراد) و خاك با PH بين 5-8 باشد قابل كشت است . به طور كلي خاك‌هاي اسيدي و زهكشي شده براي كشت نعناع فلفلي مناسب هستند، اين گياه زمستان را بصورت ركود به سرمي‌برد و در فصل بهـــار مجدداً رشد كرده و سرشاخه مي‌دهد (فصلنامه پژوهشي،1383).

1-2-3 خاستگاه و دامنه انتشار
گياهان تيره نعناع طوري در کره زمين پراکنده شده‌اند که در اغلب نواحي يافت مي‌شوند ، ولي بيشينه انتشار آنها در منطقه مديترانه است . امروزه در کشورهاي مختلف جهان ، متجاوز از چند هزار تن اسانس در سال ، از اين گياهان تهيه مي‌شود و اين خود درجه اهميت و توسعه کشت آن‌ها را در نقاط مختلف کره زمين نشان مي‌دهد. اسانس مانت کشور انگلستان که به اسانس ميچام موسوم است ، بهترين نوع آن به حساب مي‌آيد (زرگري، 1368-1380). در مورد منشاء اين گياه اختلاف نظرهايي وجود دارد. عده‌اي از گياه شناسان آسيا را منشاء نعناع مي‌دانند، در حالي‌که عده‌اي ديگر از محققان منشاء آن را انگليس دانسته و معتقدند که اين گياه در قرن هفدهم، در انگليس به وجود آمده است (اميدبيگي 1389).

1-2-4 خواص دارويي
در حال حاضر از اسانس نعناع گونه piperita همراه ديگر گونه‌هاي گياهي در ساخت داروهاي گياهي زير که در کشور ايران به ثبت رسيده است، استفاده مي‌شود. براي مثال قرص مکيدني آلتادين (موارد مصرف: التهاب‌هاي مخاط گلو و دهان)، قرص‌هاي روکش‌دار آليکوم (موارد مصرف: پايين آورنده فشار و چربي خون، ضد تصلب شرايين، ضد نفخ، اشتها آور)، گرانول پلانتاژل (موارد مصرف: اسهال‌هاي ساده)، قرص درگليس (موارد مصرف: درمان زخم معده و زخم اثني عشر، گاستريت و نفخ معده)، پودر کارامين (موارد مصرف: اختلال‌هاي هضم همراه نفخ)، شربت کاراوي ميکسچر (موارد مصرف: دل درد نوزادان و اختلالات گوارشي در کودکان) ، قرص مکيدني ماسومنت (موارد مصرف: التهاب گلو در سرماخوردگي‌ها و سرفه)، قرص جويدني مانت (موارد مصرف: اسپاسم‌هاي دستگاه گوارش، نفخ معده و به عنوان خوشبو کننده دهان)، ژل منتاژل (موارد مصرف: قارچ کچلي لاي انگشتان پا و کشاله ران، ضد خارش و سوزش، گزيدگي‌ها و سوختگي‌هاي سطحي) (ميرحيدر، 1377؛ فون ويک و وينک، 2008).

1-2-5 موارد استفاده
بيشترين مصرف نعناع فلفلي به منظور تهيه اسانس است (اميدبيگي، 1384). اسانس اين گياه در طب سنتي مورد استفاده قرار مي‌گيرد (ويکرانت و همکاران15، 2006). اين اسانس خاصيت ضد قارچي (بشهوس و ترونتون16،1997؛ پاندي و همکاران17، 1996) و ضد ميکروبي دارد (اميدبيگي، 1389؛ زماني‌زاده و همکاران، 1379؛ خان و همکاران18، 2003؛ مورراي19، 1995؛ موريرا و همکاران20، 2005). اسانس نعناع فلفلي در صنايع غذايي، بهداشتي، آرايشي، شيريني پزي، توليد ادويه و نوشابه سازي مصرف شده و از طعم آن در بهبود مزه داروهاي بدمزه استفاده مي‌گردد (ميرحيدر، 1377).
در محلول‌هاي شستشوي دهان و گلو و خمير دندان به خاطر خاصيت ضد باکتريايي منتول موجود در اسانس نعناع فلفلي، از آن استفاده مي‌شود (زماني‌زاده و همکاران، 1379). از اين گياه در تركيب داروهاي گياهي توليد شده در كشور از جمله آلتادين، ماسومنت، قطره نعناع، منتاوآليكوم استفاده شده است.

1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس
ترکيبات اصلي اسانس شامل منتول21 ، منتون22 و منتيل استات23 تشکيل مي‌دهد. اسانس گياه جهت مصارف دارويي از قسمت‌هاي هوايي گياه در آغاز مرحله گل‌دهي و با تقطير با بخارآب به دست مي‌آيد و به گونه‌اي استاندارد مي‌شود که حاوي حداقل 44درصد منتول، 15تا 30 درصد منتون و 5 درصد استر به علاوه انواع ترپنوييدها باشد. ساير ترکيباتي که در اسانس يافت مي‌شود شامل فلاونوئيد، پلي‌فنل‌هاي پليمريزه شده، کاروتن، توکوفرول بي‌تين24 و چولاين25 مي‌باشد (موراي، 1995).

1-2-7 کشت بافت گياهي
کشت بافت گياهي عبارت است از کشت درون شيشه‌اي گياهان يا بذور و اجزاي گياهي (بافت، اندام، جنين، تک‌ سلول، پروتوپلاست) در محيط‌هاي غذائي و تحت شرايط استريل. برخلاف سلول‌هاي جانوري، سلول گياهي حتي در مراحل پيشرفته بلوغ و تمايز، در صورتي‌که سيستم غشائي و هسته آن سالم و فعال باشد، توانائي تغيير به حالت مريستمي و نمو به گياه کامل را دارد. بنابراين هر قسمت از يک گياه ممکن است در شرايط مناسب و ويژه بتواند يک جنين کامل ايجاد نمايد. ايده انجام آزمايشات با استفاده از بافت‌ها و اندام‌هاي مجزا شده گياهان تحت شرايط آزمايشگاهي کنترل شده، در اواخر قرن نوزدهم مطرح شده و در تحقيقات هابرلند بيان گرديده است (ملايري، 1375). در سال 1961 روش استفاده از آگار در پتري ديش معرفي شد. در اين روش سلول‌هاي تکي را با آگار گرم شده مخلوط و حاصل را در پتري ديش به صورت يک لايه نازک پهن مي‌کردند. اين موضوع که يک سلول منفرد توانائي تقسيم و تکثير داشته و نهايتا مي‌تواند به يک گياه کامل تبديل شود در سال 1965 اعلام شد (افشاري‌پور، 1372).
مزيت تكثير از طريق كشت بافت نسبت به ساير روش‌هاي مرسوم، توليد تعداد زيادي گياه با محتواي ژنتيكي يكسان و كيفيت يكنواخت، در زمان كوتاه‌تر و فضاي نسبتاً محدود مي‌باشد (ساتيش و باوان اندان26، 1988 مانتل و هوگو27، 1989؛ باسو و چاند28، 996 ؛ شاساني و همکاران29، 1998).
در کشت بافت گياهي بيشتر اوقات يک ريزنمونه30 را براي شروع رشد در محيط کشت مصنوعي قرار مي‌دهيم سلول‌هاي غيرفعال ، تمايزيافته31 و تقسيم نشده و ريزنمونه در حين رشد در محيط غذايي ابتدا متحمل تغييراتي براي وارد شدن به حالت مريستمي مي‌شوند (آدام و ويندل32، 2005). پديده بازگشت سلول‌هاي بالغ به مرحله مريستمي و شکل‌گيري بافت کالوس را تمايززدايي مي‌نامند. از آنجا که ريزنمونه چند سلولي، متشکل از انواع مختلفي از سلول‌ها مي‌باشد بنابراين سلول‌هاي بافت کالوس نيز هتروژن خواهند بود. توانايي سلول‌هاي بافت کالوس براي تمايز يافتن به يک گياه کامل و يا يک اندام گياهي را تمايز مجدد33 مي‌نامند. اين دو پديده يعني خارج شدن از حالت تمايز با تمايززدايي و تمايز مجدد از ظرفيت‌هاي ذاتي سلول‌هاي گياهي هستند و تکامل آنها به گياه کامل به عنوان توتي‌پتانسي34 توصيف مي‌گردد. عموما قبل از اينکه سلول‌ها بتوانند وارد تمايز مجدد شده و گياه کامل توليد نمايند مرحله کالوس را بايستي بگذرانند (فارسي و ذوالعلي،1382).
همچنين استفاده از راهكارهاي فناوري زيستي از جمله كشت سوسپانسيون سلولي، كشت اندام (كشت ريشه‌هاي موئين و ساقه) راه حلي مناسب براي توليد سريع و انبوه متابوليت‌هاي ثانويه مي‌باشد (پيزوتو35، 1996؛ راو و راويش انکار36، 2002؛ بورگاد و همکاران37، 2002 ؛ مالاباگال و تساي38، 2004).

1-2-7-1 انواع کشت بافت گياهي
انواع مختلفي از کشت بافت گياهي وجود دارد (رجب‌بيگي و همکاران، 1385)
1- کشت بذر39: يک بذر ممکن است در محيط مصنوعي (in vitro) کشت شود، و يک گياهچه و نهايتا يک گياه کامل توليد کند.
2- کشت جنين40: در اين نوع کشت، جنين جدا شده، پس از حذف پوسته بذر، کشت مي‌شود.
3- کشت اندام گياهي41: يک اندام جدا شده، در محيط مصنوعي (in vitro)رشد مي‌کند. در کشت اندام، انواع مختلفي مثل جنين‌ها، بساک‌ها و تخمدان‌ها وجود دارد.
4- کشت کالوس42: اگر يک بافت تمايز يافته جدا شود و در محيط مصنوعي ، توليد يک توده سلولي تمايز نيافته به نام کالوس نمايد، اين پديده را کشت کالوس مي‌نامند.
5- کشت سلول43: کشت سلول‌هاي منفرد که به کمک آنزيم‌ها يا به روش‌هاي مکانيکي از يک بافت گياهي، کالوس يا سوسپانسيون سلولي بدست مي‌آيند، کشت سلول ناميده مي‌شود.
6- کشت پروتوپلاست44: کشت پروتوپلاست‌هائي که در اثر هضم آنزيمي ديواره سلول به وجود آمده‌اند، کشت پروتوپلاست نام دارد.

1-2-7-2 بررسي اثرات فاکتورهاي مختلف در محيط کشت
انتخاب محيط کشت يا تهيه ترکيب آن براي موفقيت در کشت بافت ضروري است. هيچ محيط کشت مشخصي را نمي‌توان براي رشد انواع سلول‌ها توصيه کرد و اغلب لازم است تغييراتي در محيط کشت براي پاسخگوئي انواع مختلف ريزنمونه صورت گيرد. بطور کلي محيط کشت حاوي نمک‌هاي غيرآلي و ترکيبات معدني مثل تنظيم کننده‌هاي رشد45 ، ويتامين‌ها، کربوهيدرات‌ها و يک عامل ژلي براي انجماد محيط کشت مي‌باشد (افشاري‌پور، 1372؛ باقري و آزادي، 1381).
بافت‌هاي گياهي کشت شده نياز به ترکيبات شيميايي غيرآلي ويژه‌اي دارند. به غير از کربن، هيدروژن و اکسيژن، عناصر اساسي ديگر که به مقادير نسبتا زيادي مورد نياز گياه مي‌باشد عبارتند از : ازت، فسفر، پتاسيم، کلسيم، منيزيم و گوگرد. به اين عناصر، پر مصرف46 مي‌گويند (افشاري‌پور، 1372).
آهن، منگنز، مس، برم، روي و موليبدن نيز براي رشد گياهان لازم است اما به مقادير خيلي کمتر. به اين عناصر کم مصرف47 مي‌گويند (افشاري‌پور، 1372). براساس توصيه‌هاي انجمن بين‌المللي فيزيولوژي گياهي، عناصري که در غلظت‌هاي کمتر از 5/0 ميلي‌مول برليتر هستند عناصر کم مصرف ناميده مي‌شوند. اين 15 عنصر که براي رشد گياهان در طبيعت مهم هستند براي کشت‌هاي بافت نيز ضروري مي‌باشند. در ترکيب نمک‌ها و يون‌هاي محيط‌هاي کشت مختلف بافت‌هاي گياهي، از نظر کمي و کيفي اختلاف اندکي وجود دارد (بوجانيس48، 1989).

1-2-7-3 نمک‌هاي غيرآلي
ترکيب نمک‌هاي غيرآلي مي‌تواند متفاوت باشد. اون و ميلر (1992) ترکيب محيط‌هاي کشتي را که بطور گسترده‌اي استفاده مي‌شوند، بدقت مورد بررسي قرار دادند و خطاي اندکي را در اين ترکيب‌ها گزارش کردند. ترکيب موراشيگ و اسکوک(1962)يا MS ترکيبي است که بطور گسترده از آن استفاده مي‌شود (اسميت و گولد49، 1989). به مقدار نمک آن بطور خاص توجه شده است. ترکيب MS به اين منظور تهيه شد تا نشان داده شود که اضافه نمودن عصاره بافت‌هاي گياهي که در آن زمان به محيط کشت اضافه مي‌شد، رشد سلولي در کشت in vitro را افزايش نمي‌دهد. ترکيب MS ثابت کرد که مواد غذائي غيرآلي، عامل محدود کننده رشد سلولي توتون نبوده و مکمل‌هاي آلي نظير عصاره مخمر، شير نارگيل، هيدروليزات کازئين و عصاره گياهي به اندازه نمک‌هاي غيرآلي ضروري نيستند (باقري و آزادي، 1381).

1-2-7-4 ويتامين‌ها
ويتامين‌هاي افزودني براي کشت سلول و بافت گياهي ضروري نيستند، هرچند که ويتامين B1 (تيامين) در کشت بافت برخي گونه‌ها سودمند به نظر مي‌رسد، با اين وجود بيوتين، پانتوتنيک اسيد، نيکوتينيک اسيد (نياسين)، پيريدوکسين(پيريدوکسال- ويتامين B6)، اسيد فوليک، اسيد اسکوروبيک (ويتامين C) و توکوفرول به برخي محيط‌هاي کشت اضافه مي‌گردند (چان و همکاران50، 2000).

1-2-7-5 منبع انرژي
سلول‌هاي سبز کشت شده، معمولا از نظر فتوسنتزي فعال نبوده و به يک منبع کربن نياز دارند. متداول‌ترين منبع انرژي کربن مورد استفاده در محيط‌هاي کشت سلول گياهي، ساکاروز است اما گلوکز و فروکتوز هم مورد استفاده قرار مي‌گيرند (فارامي و همکاران51، 2000).

1-2-7-6 ميواينوسيتول
ميواينوسيتول يک الکل-قند است که به وفور در محيط‌هاي کشتي که براي تک لپه‌اي‌ها، بازدانگان و برخي دولپه‌اي ها تهيه مي‌شود، مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اين ماده در تشکيل غشاء و ديواره سلولي نقش دارد. ميواينوسيتول را مي‌توان مستقيما به محيط کشت اضافه کرد و نيازي به تهيه محلول ذخيره نيست (بروسا و زييلجازکوو52، 2008).

1-2-7-7 عوامل فيزيکي
نور و دما از مهمترين عوامل فيزيکي موثر بر رشد مي‌باشد. نور باعث تحريک اندام‌زائي53 مي‌شود، اما از رشد ريشه جلوگيري مي‌کند. اثر نور بر اندام‌زائي ممکن است به طور مستقيم يا غير مستقيم مربوط به تجمع نشاسته در سلول‌هاي خاصي باشد و نشاسته باعث افزايش حضور سيتوکنين‌ها54 از جمله کينتين55 مي‌شود (رجب‌بيگي و همکاران، 1385). دما نيز از جمله عوامل موثر بر رشد سلول بافت گياهي است. براي اغلب کشت‌ها، دماي بين 20 تا 25 درجه سانتي‌گراد جهت رشد مناسب است. دماي بالاتر از 28 درجه سانتي‌گراد باعث تبخير آب موجود در محيط کشت شده و سبب محدوديت رشد بافت مي‌شود (اوانس و همکاران56، 1984).
1-2-7-8 ريزنمونه
عوامل مختلفي بر چگونگي پاسخ‌دهي ريزنمونه‌ها کشت شده تاثير گذارند که از آن جمله مي‌توان به ژنوتيپ گياه مادري، شرايط رشد، سن زيرنمونه، زمان انتخاب ريزنمونه و… اشاره کرد. به طور کلي بهتر است بافت‌هاي داراي سلول‌هاي زنده جوان به عنوان ريزنمونه مورد استفاده قرار گيرند، زيرا سلول‌هاي تشکيل دهنده بافت‌هاي جوان داراي واکوئل کوچکي هستند و بنابراين فعاليت و توانايي زيادي در ايجاد گياه باززائي57 شده دارند (طباطبايي و اميدي، 1390).

1-2-7-9 چگونگي انتخاب محيط کشت
انتخاب يک محيط کشت بيشتر بستگي به گونه‌هاي گياهي، بافت يا اندام مورد کشت و هدف از انجام آزمايش دارد (ديويس58، 1994). به منظور انتخاب يک محيط کشت مناسب براي کشت مورد نياز بهتر است که ابتدا با يک محيط کشت پايه مثل MS شروع نمود سپس به وسيله يک سري تغييرات کيفي و کمي در محيط کشت از طريق يک سري آزمايشات، يک محيط کشت مناسب را بدست آورد (بوجوانيس، 1989).
1-2-7-10 ريزازديادي گياهان از طريق کشت بافت
ريزازديادي59 عبارت است از تکثير درون شيشه‌اي گياه از اندام‌ها، بافت‌ها، سلول‌ها و پروتوپلاست و غيره. در برخي منابع نيز عنوان ريزازديادي طيف وسيعي از روش‌ها و تکنيک‌هاي کشت بافت را شامل مي‌شود که از جوانه، نوک ريشه، بافت، برگ‌ها، رويان‌ها، پرچم‌ها و حتي سلول‌هاي منفرد به‌عنوان ريزنمونه در آن‌ها استفاده مي‌شود ولي شناخته شده‌ترين معني ريزازديادي، تکنيک مبتني بر کشت جوانه‌هاي منفرد و يا مجتمع و يا شاخساره‌هاي حامل 2 تا3 جوانه باشد (باقري، 1386). اکثر گياهان عالي داراي مريستم‌هائي در محور برگ هستند که هر کدام قادر به ايجاد گياه کامل مي‌باشند. مريستم‌ها محل‌هائي در گياه هستند که در آنجا تقسيم سلولي ميتوز60 فعال مي‌باشد و از آن محل‌ها بافت‌هاي دائمي منشاء مي‌گيرند. گروهي از سلول‌هاي تمايز نيافته در نوک ساقه و شاخساره وجود دارند که تشکيل مريستم انتهائي61 را مي‌دهند (باقري و آزادي، 1381). همچنين اين سلول‌ها ممکن است بين آوندهاي چوبي و آبکش قرار گيرند که موسوم به کامبيوم62 مي‌باشند و يا در برگ‌هاي جوان و در قسمت پائين قطعات بين گره‌اي واقع شوند که مريستم‌هاي انترکالري63 ناميده مي‌شوند. به طور کلي هدف از ريزازديادي، حداکثر توليد از يک گياه در زمان معين و در عين حال ايجاد مجموعه‌اي از گياهان با خصوصيات ژنتيکي يکسان و با صفات کمي و کيفي مورد نظر مي‌باشد (باقري و صفاري، 1387).

1-2-7-11 ريشه‌زائي
معمول‌ترين پاسخي که در کشت ريزنمونه‌هاي مختلف گياهي در کشت بافت مشاهده مي‌شود تشکيل ريشه مي‌باشد. به طور کلي ريشه‌زائي64 در پاسخ به هورمون‌هاي اکسيني از قبيل IBA,NAA وIAA صورت مي‌گيرد. از اين ميان NAA, IBA به فراواني در مورد بسياري از گياهان استفاده شده است. براي گياهاني که به سادگي ريشه مي‌دهند اين مرحله ضروري نيست و بسياري از پروتکل‌هاي تجاري، اين مرحله را حذف مي‌کنند (ايوان و همکاران65، 2003).
1-2-8 تعريف موتاسيون(جهش)
جهش يا موتاسيون66 به طور ساده عبارتست از يک تغيير در توالي نوکلئوتيدي يک مولکول DNA (بروان67، 2009). واژه موتاسيون از کلمه لاتين (mutation) به معناي يک تغيير عمده و اساسي و ناگهاني مشتق شده است. اما تا قبل از آنکه شيوه‌هاي جديدي براي استخراج و جداسازي ژن‌ها به عنوان قطعاتي از DNA به دست آيد، تنها راه درک و فهم وجود ژن‌ها و بررسي و تعيين نقش آن‌ها، مطالعه تنوع ژنتيکي و وراثت بود. با بررسي يک تغيير و تفاوت موروثي کاملا مشخص در فنوتيپ يک موجود زنده منشاء آن را به يک ژن خاص نسبت مي‌دادند و آن تغيير را موتاسيون مي‌خواندند. گاهي نيز آسيب و تغيير در ماده ژنتيکي ممکن است در ژن‌هايي رخ بدهد که از حيث اطلاعات ژنتيکي غيرفعال باشند. نظير قطعات صامت در زنجيره DNA که اساسا از آن‌ها رونويسي68 صورت نمي‌گيرد، يا در ژن‌هايي صورت بگيرد که آن نوع ژن به تعداد زياد و مکرر در DNA وجود دارد. آسيب در اين نوع ژن‌ها نيز اثر فنوتيپي ايجاد نمي‌نمايد، اما به طور کلي آن تغييراتي در ماده ژنتيکي، موتاسيون محسوب مي‌شوند که غيرعادي و دائمي باشند. بنابراين با توجه به موارد فوق الذکر و با مدنظر گرفتن حداقل شرايط و ويژگي‌هاي تغييرات موتاسيون مي‌توان گفت که موتاسيون فرآيندي پويشي است که موجب تغيير مجموعه توارثي سلول و نهايتا ايجاد يک موجود زنده‌اي با ويژگي‌هاي جديد ژنتيکي مي‌گردد يا به‌عبارت ديگر موتاسيون، يک تغيير قابل وراثت است که بر کروموزوم اثر دائم مي‌گذارد و منجر به ايجاد يک موجود جهش يافته يا موتانت مي‌شود (بروان، 2009).

1-2-8-1 تاريخچه استفاده از موتاسيون
قدمت موتاسيون را مي‌توان معادل قدمت علم ژنتيک دانست زيرا نخستين بار Hugode Vries هلندي در سال 1901 انجمن مطالعات مورفولوژي برروي گياه پامچال به اين پديده مهم پي‌برد و ظهور خصوصيات جديد ارثي در اين گياه را موتاسيون ناميد. هرچند که پيش از نامبرده داروين در يافته بود که گونه‌ها قابليت جهش يا دگرگون ناگهاني دارند و به همين نحو لينه نيز متوجه شده بود که تعدادي از موتاسيون‌ها سيستم طبقه‌بندي و نام‌گذاري را دچاره پيچيدگي مي‌کنند اما در آن زمان ماهيت آن پديده به درستي درک نشوده بود اما ژنوتيپ‌هاي تغيير يافته به طريق مصنوعي (موتانت‌هاي القائ) اولين بار در سال 1927 توسط مولر ( با اشعه X) روي مگس سرکه و بعد از آن در سال 29-1928 توسط استولر در گياهان زراعي شناسايي شدند. اولين کار در رابطه با اشعه X در جهت مطالعات بيوفيزيکي اثرات پرتودهي روي سيستم‌هاي بيولوژيکي و ايجاد يک تغيير مفيد بوده است (استوسکوف و همکاران69، 1997).
بعد از آن به طور جدي روي جمعيت مصنوعي حاصل از موتاسيون در گياهان زراعي مختلف با استفاده از عوامل متعدد موتاژني کار شد که اين عمل به از جنگ جهاني دوم بوده است.
يکي از روش‌هاي استخراج مواد موثره گياهي با حلال است. حلال‌هاي شيميايي گوناگوني مانند اتانول، متانول، استن، گليسيرين و گلايتول‌ها مي‌توانند مورد استفاده قرار گيرند (باتالي و همکاران70، 1968).

1-2-8-2 سطوح ايجاد موتاسيون
از نظر متخصصان ژنتيک، جهش در دو سطح اتفاق مي‌افتد (ارزاني و مرتضوي1380)
1- جهش ژني: يک همرديف ژني71 مربوط به يک ژن تغيير مي‌کند و به همرديف ژني ديگري تبديل مي‌گردد. از آنجايي که اين تغيير در داخل يک ژن در يک مکان کروموزومي (نقطه‌اي) بوقوع مي‌پيوندد، اين جهش را گاهي جهش



قیمت: تومان


پاسخ دهید